绒山羊bac文的构建与鉴定以及绒毛生长发育相关基因的筛选.pdf

摘 要 绒山羊是我国珍贵的绒肉兼用品种，是不可多得的珍贵遗传资源，为了研究 绒山羊绒毛生长发育和周期性变化的分子机制，本文构建了内蒙古绒山羊基因组 的BAC文库，为绒毛生长发育的相关基因的研究、基因组物理图谱完善及BAC重 叠群的构建打下了基础。随后，本文对BAC文库进行了保存。之后又建立了高效 的PCR筛选系统，最后对绒山羊绒毛生长发育的相关基因进行了筛选，获得了 的BAC克隆，为将来定位和克隆绒毛生长相关基因打下了基础，也为进一步研究 绒山羊绒毛生长的分子机制打下了基础。BAC由于容量大、转化效率高、嵌合体 少、易操作易回收、在宿主细胞中插入片段稳定性好等特点而成为真核细胞生物 核基因组大片段插入文库制备的良好载体。BAC文库不仅可以应用于目的基因的 获得，还可应用于物理图谱的构建、基因功能结构和表达的研究，定位克隆。长 距离DNA沏,9序和锚定、鉴定假定的顺式调节元件、比较基因组学研究以及转基因 研究等。本试验从雄性阿尔巴斯绒山羊静脉血中提取自细胞，然后将自细胞包埋 进低熔点琼脂糖凝胶中，通过Hind1TI部分酶切基因组后，通过CHEF凝胶电泳技 术对大片段DNA选行两次分离，使片段大小集中。之后通过电洗脱方法回收150- 后，通过点透析对连接产物进行脱盐处理，处理后的连接产物通过电转化的方法 转化感受态大肠杆菌DHl0B。经过复苏之后将转化菌液涂布于含有氯霉素、IPTG、 X．gall拘LB平板培养基上，挑选白色克隆构建文库。本研究所构建构建的阿尔巴斯 绒山羊的BAC文库，结果如下： l 该文库含有的克隆数为276480个，分为36个超级池，每个超级池由20块 384孔板组成： 2 随机挑选的1132个克隆鉴定插入片段大小，估计文库的平均插入为128kb， 其中空克隆比例为0．53％；文库中77％的克隆插入大于100kb，有部分克隆 甚至大于300kb，文库片段大小比较集中，这样大小的插入可以满足所有 试验对于片段大小的要求。 3 以基因组大小为3·109计，文库的基因组覆盖率为11．8倍，预计从文库中筛 选到单拷贝基因的机率为99．99％。 4 整个文库以两步．4D的结构保存，并分别提取行池、列池、板池的DNA。 5 建立了高效快速的PCR筛选系统。用20个微卫星标记和5个功能基因对整 个文库进行PCR筛选，所有这些标记和基因都得到了阳性克隆，克隆数从 3到19不等，得到的平均阳性克隆数为11．3。说明文摩具有良好的覆盖率， 并且与前面鉴定结果一致。 6 筛选获得了绒山羊绒毛生长发育相关的基因MTNRla、虬廿8．1、BMp4、 FGF5幂nlGFBP5等的BAC克隆，并验证其确实为要筛选的基因。 本研究确定了高分子质量DNA获得的方法，优化了基因组部分酶切的条件， 建立了高效的连接及转化体系，建立了一套适合于本实验室的BAC文库构建体系， 并且筛选出了阳性克隆，为以后的工作奠定了基础． 关键词：绒山羊；BAC文库：构建；鉴定；保存；PCR筛选 ConstructionandCharacterizationofaCashmereGoatBAC and theGrowthand related Library screening Developmentgene ^ ● OIWOol AbStract Cashmereisoneof animalbreedsinChina．Itisfamousfor goat precious supply ofbothmuttonand cashmerefor lives．Inorderto themolecular people’S