草鱼mhcⅱb组织蛋白酶d基因的克隆、表达及多态性分析.pdfVIP

lllll I III IIIIIIII I I IIl Y2303635 符号说明 目录 摘要…………………………………………………I ABSTRACT．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．III 1引言…………………………．：……………………．1 1．1草鱼………………………………………………．．1 1．2鱼类免疫系统及相关基因的研究现状………………………．1 1．2．1免疫器官和组织……………………………………．．2 1．2．2免疫细胞…………………………………………．．2 1．2．3体液免疫因子………………………………………．2 HISTOCOMPATIBILITY 1．2．4主要组织相容性复合体(MAJOR CO～tPLEX，MHC)……3 1．2．4．3 MIlE基因在生产上的应用……………………………．．7 1 3请始轱术廊田 ．．．．．． AMPLIFICATIONOFcDNA 1．3．1快速克隆cDNA末端技术(RAPID ENDS，RACE)…9 DOWNPCR)………．．10 1．3．2巢式PER(NEST—PER)和降落PCR(TOUCH TIME OUANTIATIVEPCR)…………．11 1．3．3实时荧光定量PCR(REAL 1．4本研究的目的和意义…………………………………．．12 2材料与方法………………………………．…………．．13 2．1试验材料……………………………………………13 2．1．1试验动物…………………………………………．13 2．1．2嗜水气单胞菌………………………………………13 2．1．3主要仪器设备………………………………………13 2．1．4主要试剂…………………………………………．14 2．1．5常用溶液配制………………………………………14 2．2试验方法……………………………………………15 2．2．1引物合成…………………………………………．．15 2．2．2总RNA的提取与质量检测……………………………．．15 2．2．3草鱼基因组DNA的提取及检测…………………………．．16 2．2．4反转录合成cDNA……………………………………．17 2．2．5 RACE扩增目的基因全长cDNA序列………………………．17 II 2．2．6草鱼MHCB基因组序列扩增…………………………19 2．2．7 PCR产物片段回收……………………………………19 2．2．8PCR产物与载体的连接………………………………．．20 2．2．9大肠杆菌的转化及测序………………………………．20 2．2．10生物信息学分析……………………………………2l II 2．2．11草鱼删CB基因多态性分析………………………．．21 2．2．12人工感染草鱼试验…………………………………．21 2．2．13荧光定量PCR………………………………………22 3结果与分析…………………………………………．．23 3．1实时荧光定量PCR……………………………………．．23 II 3．2草鱼MHC B基因实验结果……………………………．．24 II 3．2．1草鱼MHCB基因cDNA的克隆及序列分析………………．24 II 3．2．2草鱼MHCB基因的多态性分析………………………．25 II 3．2．3草鱼MHCB进化树分析……………………………．28