实验六醋酸纤维薄膜电泳法分离血清要点.pptVIP

实验六 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白 实验目的 掌握电泳法分离血清蛋白质的原理； 掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作方法。 实验原理 1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。 2.影响电泳迁移率的因素： 内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 3.血清中各种蛋白质的等电点在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。 4.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 5. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。 6、在一定范围内，蛋白质含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4M氢氧化钠溶液浸洗下来进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。 实验器材 1. 电泳仪：为电泳提供直流电源。 2. 电泳槽：为电泳提供场所。 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm 5. 其它： 培养皿（直径9-10cm）、滤纸、剪刀、镊子等。 实验材料和试剂 材料：牛血清 试剂： 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6) 2、0.5% 氨基黑10B染色液 3、漂洗液 4、浸出液：0.4M氢氧化钠溶液 5、透明液：冰乙酸25ml，无水乙醇75ml，混匀即可。 实验操作 1. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。 2. 醋酸纤维素薄膜的润湿 将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后，用镊子小心夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用滤纸吸干表面液体。 3.点样 把膜条铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为好），再在膜条一端1.5-2cm处轻轻水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。此步是实验的关键。 4.电泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度电泳时间约为1h。电泳后，关闭电泳仪切断电源。 5.染色： 电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5-10min。（染色液回收） 6.漂洗： 将薄膜从染色液中取出,自来水下冲洗除去多余的染色液后放入盛有漂洗液的培养皿中漂洗，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 。 7、定量 （1）剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取一条与各区带近似宽度的无蛋白附着的空白薄膜，分别浸于4ml 0.4M氢氧化钠溶液中，37℃水浴10min，色泽浸出后，用722分光光度计在590nm处比色，以空白膜条洗出液为空白调零，测定各管的吸光度。 设各部分吸光度分别为：A白、Aa1、Aa2、 Aβ、Aγ， A总=A白+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ 蛋白含量（100%）=A/A总X100% （2）待薄膜完全干燥后，浸入透明液中约10-20min，取出，平贴于干净玻璃片上，干燥，即得背景透明的电泳图谱，可用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。 注意事项 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 5、电泳时应将薄膜的