F4ac型产肠毒素大肠杆菌菌液上清对仔猪小肠 上皮细胞的免疫刺激作用.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(4):779-785 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.018 F4ac 型产肠毒素大肠杆菌菌液上清对仔猪小肠 上皮细胞的免疫刺激作用 1 1，2 1 1 周传丽 ，刘铮铸 ，俞 英 ，张 勤 1 （中国农业大学动物科学技术学院畜禽育种国家工程实验室/农业部畜禽遗传育种重点实验室，北京 100193； 2 河北科技师范学院动物科学系，河北昌黎 066600 ） 摘要：【目的】猪源产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC ）是一类世界范围内流 行的致仔猪腹泻的病原菌。依据养猪业生产实践中对致仔猪腹泻病原菌血清学鉴定结果可知，F4ac 型 ETEC 的流 行性最为广泛。到目前为止，对ETEC 导致仔猪腹泻的机理已经有了比较透彻的阐释。但对ETEC 培养液的免疫原 性尚未有研究和描述。论文以F4ac 型ETEC 为研究对象，探索其菌液上清（即培养液）对仔猪小肠上皮细胞（IPEC-J2 ） 的免疫刺激作用。【方法】首先收集F4ac 型ETEC 菌株200 培养 12h 后的培养液，后经4℃，4 000 r/min，离心 15 min 收集培养液上清，将该上清液经0.22 µm 滤器过滤，并与DMEM/F12 培养基以1 ﹕1 的比例混合，以此混合 液共孵育 IPEC-J2 细胞 3 h，重复此处理3 次获得处理组细胞；同时设新鲜的LB 培养基与DMEM/F12 培养基同样 以1 ﹕1 的比例共孵育3 h 的IPEC-J2 细胞为对照组细胞，对照处理亦重复3 次。然后用TRIZOL 试剂按照说明书 TM 提取对照组和攻毒组 IPEC-J2 细胞的总RNA，并用TaKaRa 公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （反转录试剂盒）按照说明书将提取的总RNA 反转录成cDNA。应用文献报道或自行设计的跨内含子的引物通过实 时荧光定量PCR 方法，以猪的持家基因β-actin 作为内参，检测IL8、TNF-α、CXCL2、IL6、IL1A、TLR4、SLPI、 PLAU 和MUC13 共9 个免疫相关基因和黏蛋白基因在攻毒组和对照组中的mRNA 表达差异性。【结果】较之对照组， 在攻毒组中，3 个重要的促炎细胞因子基因 IL8、TNF-α和CXCL2 的mRNA 均出现了显著性地过表达。其中，在攻 毒组中，IL8 的表达量为对照组的3.24倍（P 0.05 ）；TNF-α的表达量亦为对照组的3.24倍（P 0.01 ）；CXCL2 的表达量为对照组的1.65 倍（P 0.001 ）。在攻毒组和对照组之间，其他6 个基因（IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU 和MUC13 ）的表达差异未达到统计学上的显著水平。【结论】研究采用F4ac 型ETEC 菌株200 的培养液上清对IPEC-J2 细胞系进行 3 h 攻毒处理，并通过荧光定量PCR 方法检测到了 3 个重要的促炎因子基因 IL8、TNF-α和CXCL2 在 攻毒组较之非攻毒组中的过表达。这表明猪F4ac 型ETEC 培养液上清对仔猪小肠上皮细胞确实具有一定的免疫刺 激作用。研究为更明确地了解猪F4ac 型ETEC 释放的肠毒素及黏附素等抗原物质对仔猪小肠上皮细胞的免疫刺激 作用提供了一定的实验证据。 关键词：F4ac 型ETEC；菌液上清；IPEC-J2 细胞；荧光定量PCR；免疫刺激作用 The Immunostimulation of F4ac ETE