‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达.pdfVIP

中国农业科学 2008,41(10):3200-3207 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.10.037 ‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达 张建成，陶能国，仝 铸，邓秀新 （华中农业大学园艺林学学院/作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070 ） 摘要： 【目的】克隆、分析‘红肉脐橙’（Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara）八氢番茄红素合成酶 （phytoene synthase，PSY）基因，并进行原核表达。【方法】以‘红肉脐橙’果实中分离的mRNA 为模板，通过 RT-PCR 扩增到 PSY cDNA 片段，并分析其序列；利用 PCR 技术获得‘红肉脐橙’PSY cDNA 的编码区全长，并将其 克隆到原核表达载体pET28a(+)，获得重组质粒pET-CitPSY 转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】‘红 肉脐橙’PSY cDNA 长 1 520 bp，最大开放读码框为 1 308 bp，可编码 436 个氨基酸，核酸序列及其推导的氨基 酸序列与已知其它植物PSY 核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在75%和70%以上，并且发现‘红肉脐橙’PSY的 N 末端存在转运肽信号序列，成熟的 PSY 包含 1 个跨膜结构域。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白 6 ×His-PSY，Western-blot 试验证实表达的融合蛋白能与抗 6×His 的单抗发生特异性反应，分子量约为 52 kD。 【结论】该研究为进一步开展柑橘果实色泽分子改良奠定了基础。 关键词：红肉脐橙；八氢番茄红素合成酶；原核表达 Phytoene Synthase Gene Cloning from Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara and Its Prokaryotic Expression ZHANG Jian-cheng, TAO Neng-guo, TONG Zhu, DENG Xiu-xin (College of Horticulture and Forestry, Huazhong Agricultural University/National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Wuhan 430070 ) Abstract: 【Objective 】The present study aimed at cloning and analyzing the PSY gene of Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara and expressing it in the prokaryote. 【Method 】Using the mRNA from the fruit of Cara Cara as the template, the cDNA of PSY gene was amplified by Reverse Transcription Polymerse Chain Reaction (RT-PCR) and its sequence was analyzed. The full coding sequence of PSY cDNA was cloned using PCR and further subcloned into pET28a (+). The recombinant plasmid pET-CitPSY was expressed in a prokaryotic expression system after its transformation into BL21 (DE3). 【Result 】