Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达.pdfVIP

中国农业科学 2012,45(16):3414-3421 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.16.022 Mmu-miR-34c 慢病毒表达载体构建及 在奶山羊雄性生殖干细胞的表达 刘 超, 于 萌，朱海鲸，李明昭, 华进联 （西北农林科技大学动物医学院/ 陕西省干细胞工程技术研究中心/农业部动物生物技术重点开放性实验室, 陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】用两种方法构建miR-34c 的慢病毒表达载体，并包装成慢病毒颗粒，为经济、高效的进行miR-34c 超表达提供方案，为进一步研究miR-34c 的作用奠定基础。【方法】 从小鼠基因组中扩增miR-34c 前体，分别插 入pLL3.7 的CMV 启动子起始的GFP 之后或U6 启动子后，构建成载体pLL3.7-CMV-34c 及pLL3.7-U6-34c。将重组 慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T 细胞，包装产生慢病毒颗粒，测定病毒滴度。感染293T 细胞与 关中奶山羊雄性生殖干细胞，用293T 细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP 表达程度测定转染效率，用定量PCR 方 法测定miR-34c 的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR 分析及转化菌液测序，证明插入序列正确，qPCR 检测 显示：miR-34c 的表达在慢病毒载体感染的293T 细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7 慢病毒载体中的CMV 和U6 两种启动子均可经济高效地进行miR-34c 超表达，且由U6 启动子启动的miR-34c 慢病 毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。 关键词：miR-34c；慢病毒载体；雄性生殖干细胞；奶山羊 Construction of miR-34c Lentiviral Expression Vector and Its Infection in Dairy Goat Germ Line Stem Cells LIU Chao, YU Meng, ZHU Hai-jing, LI Ming-zhao, HUA Jin-lian (College of Veterinary Medicine, Northwest AF University/Shaanxi Stem Cell Engineering and Technology Research Center/ Key Lab for Animal Biotechnology of Agriculture Ministry, Shaanxi Yangling 712100) Abstract: 【Objective 】In order to over-express mouse miR-34c economically and efficiently, mouse miR-34c lentiviral expression vector was constructed using two different methods. 【Methods 】The pri-miR-34c was amplified and inserted into downstream of CMV and U6 promotors in pLL3.7, respectively. The recombinant lentiviral vector together with lentivirus package plasmid mixtures were transfected into 293T cells to package virus. The titres of the viruses were examined and then the vir