大豆硫转运蛋白基因GmSULTR1;2b启动子的克隆及活性分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(8):1650-1659 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.08.20 大豆硫转运蛋白基因 GmSULTR1;2b 启动子的克隆及活性分析 周小琼，丁一琼，左 丽，喻德跃 （南京农业大学农学院/ 国家大豆改良中心/作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095 ） 2- 摘要：【目的】硫转运蛋白（sulfate transporter，SULTR）参与根系对外界环境中硫酸根（SO ）的吸收与 4 转运。大豆硫转运蛋白基因 2- GmSULTR1;2b 在根中特异表达，其功能是将外界的 SO 吸收转运到植物根系中。文章 4 克隆大豆硫转运蛋白 GmSULTR1;2b 的启动子，研究该启动子的驱动活性和组织表达情况，从而了解 GmSULTR1;2b 的调控机制，为提高大豆含硫氨基酸含量提供分子依据。【方法】根据 NCBI 中GmSULTR1;2b 的序列，分析预测该 基因上游 2 259 bp 为启动子，并利用在线数据库 PLACE 和 Plant-CARE 预测该启动子序列的调控元件。以大豆品 种南农 N2899 的 DNA 为模板，进行普通 PCR 扩增，将克隆的启动子序列与 GUS 连接构建植物重组表达载体 pSULTR1;2b∷GUS。利用冻融法将重组质粒转入农杆菌 EHA105 中，通过农杆菌介导的遗传转化法转化大豆进行瞬 时表达，以GUS 为报告基因对启动子的活性进行分析。另外，将重组质粒转入发根农杆菌K599中进行大豆毛状根 转化试验，借助于 GUS 报告基因，通过体视镜观察毛状根的横切面，分析启动子在根中的表达情况。最后以转化 的阳性毛状根为材料，通过GUS酶活试验（GUS activity）分析启动子的活性。【结果】克隆大豆品种南农N2899 的GmSULTR1;2b 启动子与NCBI序列基本一致。通过在线预测分析启动子的调控元件发现该启动子具有真核生物启 动子必须的核心元件 TATA-box 外，还含有激素应答元件 ERE（乙烯响应元件）、ABRE（脱落酸响应元件）等，胁 迫应答元件TC-rich repeats（干旱胁迫以及病虫害胁迫）、AT-rich element（AT-rich的DNA与蛋白结合位点） 和MYB等。重组载体pSULTR1;2b∷GUS经PCR和测序鉴定，证实已构建成功。大豆瞬时表达后进行X-gluc染色显 示，重组载体侵染的大豆显蓝色，说明GmSULTR1;2b 启动子能够驱动下游 GUS 的表达。对转化的毛状根染色之后， 体视镜下观察阳性根的横切面，发现 GUS 主要在根毛、根表皮和中柱内表达，表明 GmSULTR1;2b 启动子主要在根 毛、根表皮和中柱内表达。对转化毛状根进行GUS酶活试验（GUS activity）说明该启动子的启动活性比 CaMV35S 启动子的启动活性弱。【结论】克隆了GmSULTR1;2b 启动子序列，该启动子具有驱动下游 GUS 的表达的功能，而且 该启动子在根毛、根表皮和中柱内表达。 关键词：大豆；GmSULTR1;2b；启动子；瞬时表达；GUS活性 Cloning and Act