大蒜蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）的酶学特征.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(2):334-342 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.13 大蒜蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）的酶学特征 文 明，卜利伟，罗紫韵，王佳伟，董 芬，黄雪松 （暨南大学食品科学与工程系，广州 510632 ） 摘要：【目的】研究大蒜（Allium sativum L.）中蔗糖 ﹕蔗糖 1-果糖基转移酶（1-SST）的酶学特征，为大 蒜保鲜、加工和品质改良提供依据。【方法】采用饱和度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100% 的硫酸铵分级沉淀 1-SST，以确定其所在的硫酸铵部位。分别取 1-SST 活力最高的硫酸铵部分与底物蔗糖反应， 研究其在不同的温度、pH、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖的能力，即采用高效液相色谱-蒸发光 散射（HPLC-ELSD），测定1-SST反应前后的1-蔗果三糖的含量，进而计算出1-SST活力大小并总结出其在不同的 温度、pH、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖反应的规律；采用的色谱柱为Prevail Carbohydrate ES柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），色谱柱柱温箱温度为40℃，流动相最大限压20 MP，流动相为乙腈和水，其流 速为1.0 mL·min-1 -1 ，ELSD撞击器关闭状态，漂移管温度90℃，载气流量2.5 L·min （空气）。其梯度洗脱方式为： 0 min，75%乙腈 ﹕25%水；15 min，65%乙腈 ﹕35%水；30 min，50%乙腈 ﹕50%水；35 min，75%乙腈 ﹕25%水；40 min， 75%乙腈 ﹕25%水。【结果】在上述测定条件下，果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖6种糖完 全分离，出峰时间仅为20 min，测定方法可靠、灵敏度高，满足了测定1-SST活性的要求。以50%（w/w）蔗糖为 底物时，仅产生1-蔗果三糖，无其它高果聚糖的产生，证实了在所试条件下，大蒜中1-SST反应具有专一性。大 蒜1-SST主要存在于30%—40%硫酸铵饱和度部分，其中0—30%，40%—70%有轻微活力，未发现70%—100%硫酸铵 组分有 1-SST 的活力。取 30%—40%的硫酸铵饱和度部分作为样品研究 1-SST 酶学特征发现其最适反应温度为 35 ℃，当温度到达40℃以上时，酶的活力下降的很快，说明1-SST具有热不稳定性，因此在研究大蒜1-SST时，要 尽量避免高温，以免影响后续研究；其最适反应pH为5.0，与大麦（Hordeum vulgare ）、菊苣（Cichorium intybus L.）、菊芋(Helianthus tuberosus Colombia )、黑麦草（Lolium rigidum ）、龙舌兰（Agave americana L.）的 1-SST最适pH 大致相同，显示不同植物1-SST活力中心部位的结构可能基本一致；在蔗糖浓度为100—600 mg·mL-1 -1 内，酶活力随着底物质量浓度的增加而提高，而当底物浓度超过 500 mg·mL 时，酶活力增加的幅度减少而趋 + - 于平缓，这完全符合米氏方程（Michaelis-menten ）的酶动力学性质；对于 Na、Cl 来说，离子强度越低， 1-SST 活力越强，1-SST 在 35℃下的米氏常数 Km 为 104 -1 mmol·L 。【结论】大蒜 1-S