单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶编码基因Tri101的 原核表达及多克隆抗体制备.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(16):3369-3376 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.007 单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶编码基因Tri101 的 原核表达及多克隆抗体制备 董 飞，祭 芳，吴季荣，殷宪超，徐剑宏，史建荣 （江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/江苏省转基因生物安全评价公共技术服务中心，南京 210014 ） 摘要： 【目的】克隆Tri101 并通过原核表达获得纯化蛋白，通过免疫 SPF 大白兔获得高效价、高灵敏度的 多克隆抗体，为Tri101 蛋白及转Tri101 作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium ） F3210 为材料，PCR 法获得Tri101 并连接至表达载体pET29a （+），将重组表达载体转化大肠杆菌BL21 （DE3）后 利用IPTG 进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS分析结果表明，Tri101 在大肠 杆菌BL21 （DE3）中得到表达，重组蛋白大小为50 kD 左右，以包涵体形式存在。利用HisTrap 亲和柱纯化重组 -1 蛋白，最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol·L 。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His 标签，酶切产物经HisTrap 亲和柱再次纯化后免疫SPF 大白兔，制备多克隆抗体。经ELISA 法检测抗体效价为 1 ﹕12 000，检测灵敏度 -6 -1 为 0.05 ×10 µg·mL 。Western blotting 结果证明制备的多克隆抗体对Tri101 具有较好的专一性。【结论】通 过Tri101 的克隆及原核表达，获得了纯化的融合蛋白，通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体，可用于Tri101 蛋 白及转Tri101 小麦的检测。 关键词：单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶；Tri101；原核表达；多克隆抗体；小麦赤霉病 Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Trichothecene 3-O-Acetyltransferase Gene Tri101 DONG Fei, JI Fang, WU Ji-rong, YIN Xian-chao, XU Jian-hong, SHI Jian-rong (Institute of Food Safety and Detection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Centerfor GMO Evaluation and Detection, Nanjing 210014) Abstract ：【Objective 】Tri101 was cloned and the purified protein was obtained by prokaryotic expression. Polyclonal antibody of high titer and high sensitivity was obtained by SPF rabbits immunization, thus providing a basis for the establishment of the transgenic plants and products. 【Method 】Tri101 was obtained from Fusarium graminearium Schwabe F3210 by PCR and connected to the expression