稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015的T-DNA标记基因的克隆.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(13):2552-2562 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.007 稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015 的 T-DNA 标记基因的克隆 1,2 2 2 2 2 2 2 1,2 黄 磊 ，胡建坤 ，俞咪娜 ，于俊杰 ，王亚会 ，郑梦婷 ，郑 睿 ，刘永锋 1 2 （南京农业大学生命科学学院，南京 210095 ； 江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014 ） 摘要：【目的】研究稻曲病菌（Ustilaginoidea virens ）致病力丧失突变菌株B-1015，克隆和分析T-DNA 插 入位点的侧翼序列，为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌T-DNA 插入突变体B-1015 菌株 的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及致病力等生物学表型。用PCR 检测T-DNA 在B-1015 基因组中插入的稳定性， 用Southern 杂交检测T-DNA 插入的拷贝数，用hiTail-PCR 扩增T-DNA 侧翼序列，用RACE PCR 克隆T-DNA 标记基 因，半定量RT-PCR 分析所克隆基因的表达情况。【结果】与野生菌株P1 相比，突变菌株B-1015 的生长速率和产 孢量都有较明显的降低，孢子萌发率无明显差异，致病力丧失。分子检测结果表明T-DNA 在B-1015 基因组中为稳 定的单拷贝插入。hiTail-PCR 得到的T-DNA 两端侧翼序列在野生型菌株基因组上不相连，RACE PCR 在两边的侧翼 序列上分别克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。预测分析表明Uvt-1015R包含一个长度为948 bp 的开放阅读框（open reading frame finder，ORF ），可编码295 个氨基酸，5′端非编码区（5′-untranslated regions，5′-UTR ）长度 为 341 bp，3′端非编码区（3′-untranslated regions，3′-UTR ）长度为271 bp。Uvt-1015L包含一个长度为 351 bp 的ORF，可编码116 个氨基酸，5′-UTR 为 31 bp，3′-UTR 长度为 174 bp。在已知功能的蛋白中检索，没有发现与 Uvt-1015R 和Uvt-1015L 基因同源的蛋白。序列分析发现T-DNA 插入在两个基因序列中间，RT-PCR 结果显示，在 突变菌株B-1015 中，Uvt-1015R 表达量下降，Uvt-1015L 不表达。【结论】 稻曲病菌突变菌株B-1015 致病力等重 要生物学表型发生改变，可能是由于T-DNA 的插入导致了B-1015 基因组重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L 基因结构 的破坏。 关键词：稻曲病菌；致病力；T-DNA；基因克隆 Molecular Cloning of T-DNA Targeted Genes of Ustilaginoidea virens Pathogenicity-Defective Mutant Strain B-1015 1,2 2 2 2 2 HUANG Lei , HU Jian-kun , YU Mi-na , YU Jun-jie , WANG Ya-hui , 2