大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(2):343-351 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.14 大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析 1,2 2 1 苏鲁方 ，彭学强 ，蒋曹德 1 2 （西南大学动物科技学院/重庆市草食动物资源保护与利用工程研究中心，重庆 400715 ； 西南大学生命科学学院，重庆 400715 ） 摘要：【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2（pleckstrin homology-like domain, family A, member 2）基因序 列，分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系，为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。 【方法】根据人、牛和猪PHLDA2 的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分cDNA序列，进一 步利用5′-和3′-RACE技术获得全长cDNA序列;利用ORF Finder和ProtParam等在线工具分析PHLDA2基因序列特 征;采用Real-time PCR方法分析 PHLDA2 在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10 个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊 PHLDA2 基因序列 SNP 位点，基于表达 SNP 的方法分析该基因在 F1 代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析 PHLDA2 表达量与胎盘性状的关系。【结果】克隆得到 935 bp 大 足黑山羊 PHLDA2 的cDNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp，其编码140 个氨基酸。预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da，等电点为9.18，二级结构由α-螺旋(37.14%)、 β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成, 并且包含保守的PH（pleckstrin homology）结构域。 ③BLAST 分析发现，山羊 PHLDA2 定位于 29 号染色体，其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性 分别达到 91%，90%，90%,90%和 89%，在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。④荧光定量 PCR 结果显示 PHLDA2 在山羊胎盘中表达量最高（P 0.01)，在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且 差异不显著（P 0.05), 在脾中未检测到表达。⑤印记分析表明，PHLDA2 在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表 达母源等位基因，但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。⑥PHLDA2 表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n 2 = 15，R =0.855，P 0.01）。【结论】山羊 PHLDA2 基因序列和结构特征具有物种间的保守性，但是其印记状况具 有组织特异性; PHLDA2 为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。 关键词：山羊；PHLDA2；基因克隆；荧光定量PCR；组织表达；印记分析 Cloning, Tissue Expression and Imprinting Analysis of PHLDA2 Gene in Dazu Black Goat 1,2 2 1 SU Lu-fang , PENG Xue-qiang , JIANG Cao-de