飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(1):73-82 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.01.08 飞蝗表皮蛋白 Obstructor 家族基因的分子特性 及基于RNAi的功能分析 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 2,3 1,2 王 燕 ，李大琪 ，刘晓健 ，李 涛 ，马恩波 ，范仁俊 ，张建珍 1 2 3 （山西大学应用生物学研究所，太原 030006 ；农业有害生物综合治理山西省重点实验室，太原 030006 ；山西省农业科学院植物保护研究所，太原 030031 ） 摘要： 【目的】获得飞蝗（ Locusta migratoria ）表皮蛋白Obstructor （Obst ）家族基因的 cDNA 序列，并 研究其序列特征和 mRNA 表达特性，探讨其生物学功能，为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学 方法搜索飞蝗转录组数据库获得 Obst 家族基因 cDNA 片段，并进行 BLAST 分析得到 Obst 家族基因的 cDNA 序列； 采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列，拼接后获得全长；SignalP在线软件分析蛋白的信号肽，SMART网 站预测其功能域，并使用 Mega 5.10 软件中 Neighbor-Joining 方法，与黑腹果蝇（Drosophila melanogaster ） Obst 家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneum ）CPAP3 家族基因（Obst 家族基因的同源基因）氨基酸序列进 行聚类分析；采用 real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测 LmObst 家族基因在 5 龄若虫不同组织部位和 不同龄期体壁的表达情况，绘制表达图谱；采用RNA干扰（RNAi）技术探讨 LmObsts 对飞蝗发育的影响。【结果】 在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段，通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、 黑腹果蝇 Obst 高度同源，属于 LmObst 家族基因片段，其中5个是全长序列，3个序列缺失3′端；采用RACE技术 获得3′末端cDNA序列；将得到的8个 LmObst 家族基因全长序列进行功能域分析，发现具有 Obst 家族表皮蛋白的 特点，即有1 个信号肽与3 个几丁质结合域ChtBD2；并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建，根据 进化树分析结果，分别命名为 LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1 和 LmObst-E2。qPCR 结果显示 LmObst-E1 和 LmObst-E2 在前肠和后肠高特异性表达，LmObst-D1 在体壁和前肠高 表达，其他 LmObsts 在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达，在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达； LmObst 家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近，在5 龄前期高表达，中期降到最低，蜕皮前又上 升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能，5龄若虫第5天分别注射dsLmObst，对照组注射等量dsGFP， 48 h 后检测沉默效率，发现目的基因表达量显著降低；进一步观察发现，注射 dsLmObst-E1 的 5 龄若虫 80%无蜕 皮迹象，在 5 龄若虫状态下死亡，剩余 20% 若虫蜕皮延迟 1—2 d，并且蜕至成虫后，16 h 内全部死亡；其余注 射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟 1—3 d 的现象，但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得 8 个飞蝗 LmObst 家族基因