多年生黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP的克隆及功能分析.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(12):2412-2420 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.12.002 多年生黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP 的克隆及功能分析 周春蕾，李 仁，吴新新，杨荣超，张海军，张 娜，赵 冰，郭仰东 （中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193） 摘要：【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控，克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA 序列，并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE 技术从黑麦草（品种“顶峰”）中获得LpAQP 全长cDNA 序列； 运用生物信息学软件分析其编码蛋白；构建LpAQP 与GFP 融合的瞬时表达载体，采用基因枪法转入洋葱表皮细胞， 观察其细胞定位；通过real time-PCR 分析LpAQP 的表达模式，并用Southern 杂交分析其拷贝数。【结果】克隆 获得LpAQP 的cDNA 序列，GenBank 登录号为JX569791，其开放阅读框（ORF）为867 bp，编码288 个氨基酸，蛋 白质分子量为30.7 kD。该基因含有2 个NPA 单元，6 个跨膜区，LpAQP 含有与MIP 家族完全一致的蛋白质保守区， 其氨基酸序列与其它禾本科PIP 类质膜型水通道蛋白同源性较高。物种间聚类分析表明LpAQP 与大麦、小麦质膜 型水通道蛋白同源性较高。LpAQP 可能定位于细胞质膜上。通过Southern 杂交分析，发现LpAQP 在黑麦草基因组 中以单拷贝存在。real time-PCR 分析表明LpAQP 在黑麦草茎部表达高于叶和根，持续干旱胁迫会导致LpAQP 表 达量先上调后下降。【结论】克隆获得黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP，其以单拷贝形式存在，在黑麦草根、 茎、叶中均有表达，尤其是茎中表达最高。其表达受干旱胁迫影响。 关键词：黑麦草；水通道蛋白；细胞定位；real time-PCR Cloning and Functional Analysis of the Plasma Membrane Aquaporins Gene in Lolium perenne L. ZHOU Chun-lei, LI Ren, WU Xin-xin, YANG Rong-chao, ZHANG Hai-jun, ZHANG Na, ZHAO Bing, GUO Yang-dong (College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193) Abstract: 【Objective 】To provide an insight into mechanism of drought resistance and cultivar development in Lolium perenne L., the sequence characteristics of the aquaporin gene LpAQP in L. perenne L. was analyzed and the expression profiling was studied. 【Method 】The full-length cDNA sequence of LpAQP was isolated by RACE. The obtained cDNA sequence and the deduced amino acid sequence was analyzed. In order to follow the intracellular localization of the protein, the GFP sequence was fused downstream to the LpAQP coding region and the fusion gene LpA