动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(19):3931-3940 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.19.015 动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立 1 1 2 1 1 1 聂雯莹 ，罗晓琴 ，李金超 ，李 行 ，吴 广 ，王琳琛 1 2 （北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206 ； 河北省兽药监察所，石家庄 050035 ） 摘要：【目的】苯乙醇胺A为一种新型违禁添加剂，目前的检测方法繁琐耗时，故建立动物尿液中苯乙醇胺A 胶体金免疫层析快速检测方法。【方法】通过苯乙醇胺A 与溴代戊醛发生亲核取代反应，制备得到苯乙醇胺A半抗 原，将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原，经TNBS法测定半抗原与载体蛋白偶联比。用免疫 原免疫BALB/c 小鼠，制备特异性单克隆抗体，采用间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。选取与苯乙醇 胺A结构类似的13种同类药物利用间接竞争ELISA方法进行单克隆抗体特异性的测定，计算交叉反应率。并通过 胶体金、单克隆抗体-胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜、样品吸收垫的制备以及试纸条的组装，建立了动物 尿液中苯乙醇胺 A 胶体金快速检测方法，测定试纸条的检测限、假阳性率、假阴性率以及与 ELISA 方法的检测猪 尿样品结果比较，验证试纸条的准确度，其中ELISA方法的标准品浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg·L-1 ， 对猪尿样品的最低检测限为 0.5 μg·L-1 ，回收率为 75%—105%。【结果】苯乙醇胺 A 半抗原制备结果显示从苯乙醇 胺A的氨基端引入末端代醛基的连接臂，得到苯乙醇胺A衍生物，即苯乙醇胺A半抗原。TNBS法测定结果显示苯 乙醇胺A-BSA 和苯乙醇胺A-OVA成功偶联，苯乙醇胺A半抗原-BSA偶联比为11.38，苯乙醇胺A半抗原-OVA偶联 比为 10.66。间接 ELISA 检测结果显示 MC-73 杂交瘤细胞株的上清效价为 1 ﹕2×103 7 ，腹水效价为 1 ﹕5×10 ，较 MC-33和MC-29 的效价高，抗苯乙醇胺A单克隆抗体对苯乙醇胺A的IC -1 50 为0.365 μg·L ，较MC-33和MC-29的IC50 低，得到MC-73单克隆抗体腹水灵敏度最高。苯乙醇胺A 单克隆抗体与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等共13 种苯乙醇胺A 的同类化合物的交叉反应率均小于1%，试纸条检测限为5 μg·L-1 ，假阳性率为0，假阴性率为0。检 测实际动物尿液样品时，试纸条与ELISA 测定结果没有差异。【结论】成功研制出灵敏、特异、简便、快速的苯乙 醇胺 A 胶体金免疫层析试纸条，可直接检测动物尿液，无需样品前处理，反应只需 5 min 即可得到检测结果。适 合中国基层兽药检测实验室和企业大批量样品集中筛查及现场检测。 关键词：苯乙醇胺A；胶体金免疫层析；快速检测试纸条；动物尿液 Establishment of a Detection Method for the Immune Colloidal Gold of Phenylethanolamine A in Animal Urine 1