多转座子载体的构建及转座特性比较研究.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(11):2270-2278 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.018 多转座子载体的构建及转座特性比较研究 沈 丹，谢雨琇，李庆平，薛松磊，史云强，王赛赛，陈 才，钱 跃，高 波，崔恒宓，宋成义 （扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009 ） 摘要：【目的】转座子（transposon, Tn）是染色体上可自主复制和移位的基本单位，普遍存在生物体基因 组内，Sleeping beauty（SB）、piggyBac（PB）和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼，是目前脊椎动物 中活性较高的转座子。比较了这 3 种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率，从而获得细胞水平上的高 活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR 法分别从SB、PB和Tol2 3种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转 座元件，测序正确后，将各转座元件依次亚克隆至 pT2-HB 载体框架，构建成包含这 3 种转座子的多转座子载体 pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP 和新霉素表达框PGK-NEO 分别克隆至pT3-PST载体，获得两个表达载体 pT3-PST-CAG-GFP 和 pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒 pCMV-SB100X、 pCMV-HAhyPBase、 pCMV-Tol2 以 1 ﹕1 质量比混合，经多聚阳离子 PEI 包裹，共转染小鼠胚胎成纤维细胞（3T3），同时以突变失活 的转座酶质粒 SB△DD 与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染 GFP 36 h 后，用荧光显微镜进行检测 GFP 表 达率，提取细胞基因组，以 Amp 基因作为内参，进行实时荧光定量 PCR，检测 GFP 插入拷贝数；根据被剪切位 置上下游序列设计引物，进行实时荧光定量 PCR，检测 3 种转座子的剪切效率。细胞转染 NEO 48 h 后，用浓度 为 500 µg·mL-1 的 G418 进行耐药性筛选，至正常细胞基本全部死亡（10 d），将细胞进行吉姆萨染液染色，统计 耐药细胞数，从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体 PT3-PST、pT3-PST-CAG- GFP 和 pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于 50%，且差异不显著（P ＞0.05）。SB 组 GFP 相对拷贝数高于 Tol2 和 PB 组，但差异不显著（P ＞0.05），均显著高于对照组（P ＜0.05）。SB 和 PB 组剪切效率显著高于 Tol2 组（P ＜ 0.05），但 SB 和 PB 组之间差异不显著（P ＞0.05）。pT3-PGK-NEO 与转座酶共转染 3T3 细胞，G418 抗性筛选结果 表明，SB 组耐药细胞数显著高于 PB 和 Tol2 组（P ＜0.05），但 PB 和 Tol2 两组差异不显著（P ＞0.05），此 3 组 均极显著高于阴性对照组（P ＜0.01）。【结论】SB 转座子系统在细胞水平的转座效率优于 PB 和 Tol2，为细胞水 平的转基因研究提供有效基因转移工具。 关键词：SB转座子；PB转座子；Tol2转座子；胚胎成纤维细胞；转座活性 Construction of Multi-Transposon Vectors, and Comparative Study of Transposon Characteristics SHEN Dan, XIE Yu-xiu, LI Qing-ping, XUE Song-lei, SHI Yun-qiang, WANG Sai-sai, CHEN Cai, QIAN Yue, GAO Bo, CUI Heng-mi, SONG Cheng-yi