鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建.pdfVIP

中国农业科学 2010,43(7):1464-1472 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.07.018 鹅源草酸青霉CBH Ⅰ基因克隆及真核表达载体构建 1，2 1 1 2 1 2 王宝维 ，张 倩 ，葛文华 ，张名爱 ，岳 斌 ，黄国清 1 2 （青岛农业大学优质水禽研究所，山东青岛 266109 ； 青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109 ） 摘要：【目的】鹅源草酸青霉 F67（ Penicillium oxalicum Currie ＆ Thom）纤维素酶二糖水解酶 （cellobiohydrolase, CBHⅠ）基因克隆并构建真核表达载体，为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维 素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段，然后利用改良热不对称交错PCR（TAIL-PCR） 技术克隆 CBHⅠ基因 5′端和 3′端侧翼序列，最后采用 RT-PCR 法扩增鹅源草酸青霉 F67 CBHⅠ基因序列全长，并 对该基因进行生物信息学分析，构建 pPIC9K 真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉 F67 纤维素酶 CBHⅠ基因片段 A(EU574736)、5′端序列 B1(EU603295)、3′端序列 B2(EU652768)及全长基因 C(EU727171)，并成 功构建真核表达载体pPIC9K-CBHⅠ；生物信息学分析表明，该基因蛋白序列与微紫青霉氨基酸序列同源性最高， 达 76%，前 26 个氨基酸为信号肽序列，疏水性可达 2.63，由催化功能域、衔接区和真菌性纤维素结合域构成， 其三级结构主要为β-sheet。【结论】鹅源草酸青霉纤维素酶 CBHⅠ基因全长序列的克隆进一步丰富了丝状真菌 的生物信息学资源；其真核表达载体的构建为将该菌株进一步在真核宿主中表达，从而获得高效工程菌株奠定了 基础。 关键词：鹅源草酸青霉；外切葡聚糖酶；TAIL-PCR Cloning of the CBHI Gene of Goose-Origin Penicillium oxalicum Currie Thom and Its Eukaryotic Expression Vector Construction 1,2 1 1 2 1 2 WANG Bao-wei , ZHANG Qian , GE Wen-hua , ZHANG Ming-ai , YUE Bin , HUANG Guo-qing 1 2 ( High Quality Waterfowl Research Institute, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong; College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong) Abstra