多能性转录因子mRNA转染山羊胎儿成纤维细胞条件优化.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(20):4159-4169 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.20.015 多能性转录因子mRNA转染山羊胎儿成纤维细胞条件优化 肖天荣，张 蕾，邱峰龙，李 伟，左其生，李 东，李碧春 （扬州大学动物科学与技术学院/江苏省动物繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州 225009 ） 摘要：【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast，GEF）的条件，本试验针对转染试剂脂质体2000 和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶 消化法，从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit试 剂盒说明书，体外转录步骤主要有：①前期的质粒准备：首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体 质粒进行提取，随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切，获得线性化质粒，最后用 DNA 纯化试剂盒对 线性化的质粒进行纯化；②mRNA 的 “加帽”：以线性化 DNA 为模板，合成带有 5′端帽子结构的 mRNA，添加 TURBO DNase 以除去模板 DNA；③mRNA 的“加尾”：以 ATP 为原料，利用试剂盒自带的 Poly(A)聚合酶，对已经“加帽” 的mRNA进行“加尾”，以合成结构完整的mRNA；④完整mRNA的纯化：按照MEGAclearTM Kit试剂盒对mRNA进行纯 化。随后，将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA（EGFP和4种多能性转录 因子的mRNA的质量分别为0.2µg）和脂质体2000 的比例为1׃0.5、1׃1.0、1׃1.5、1׃2.0以及在最佳总mRNA 与脂 质体 2000 比例体系下第 2、4、6 代 GEF 细胞的 mRNA 转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子 mRNA 的 GEF 细胞进行免疫荧光检测，并对转染多能性转录因子 mRNA 后 GEF 细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA 和 脂质体 2000 的比例为 1׃1.0 以及在最佳总 mRNA 与脂质体 2000 比例体系下第 2 代 GEF 细胞的 mRNA 转染效率均显 著高于其他组（P ＜0.05），且本组细胞在形态和生长方面相对较好；免疫荧光检测表明，4 种多能性转录因子的 mRNA 在 GEF 细胞中定位于细胞核，并获得稳定表达，在细胞质中不见多能性转录因子 oct4、sox2、klf4、c-myc 的表达；GEF细胞在转染4种mRNA 24h后，细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢；细胞活力低于对照组（山羊成纤维 细胞正常生长组）。【结论】GEF 细胞在总 mRNA 和脂质体 2000 的比例为 1׃1.0 以及在最佳总 mRNA 与脂质体 2000 比例体系下第 2 代 GEF 的条件下更适合 mRNA 的转染。研究工作为 mRNA 转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能 干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）的获得提供参考资料，并对 mRNA 在成纤维细胞中的去向提供 间接证据，有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。 关键词：mRNA；转染；山羊胎儿成纤维细胞；转录因子 The Optimization of Transfection Conditions for Transfecting Pluripotent Transcription Factors mRNA to GEF Cells XIAO Tian-rong, ZHANG Lei, QIU Feng-long, LI Wei, ZUO Qi-sheng ，LI Dong, LI Bi-chun (Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Province