牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(23):5026-5036 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.23.020 牛SREBP1 基因shRNA 序列的筛选及 其腺病毒载体的构建与鉴定 1 1,2 1 1,2 1,2 1 1 1 1 付常振 ，昝林森 ，王 虹 ，成 功 ，王洪宝 ，李耀坤 ，姜碧杰 ，高建斌 ，杨 宁 1 2 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100 ； 国家肉牛改良中心，陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1 基因的有效 shRNA，构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒，为 在细胞水平上研究SREBP1 基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1 基因为研究对象，首先靶向 其编码区（coding sequence ，CDS ）序列设计并合成 6 条干扰和 1 条阴性对照 shRNA，并构建表达载体 pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK- Ⅱ-SREBP1 共转染293A 细胞，筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选 的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC 分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组，得到腺病毒重组载体， 并在293A 细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒，GFP 标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞，实时荧 光定量法（qRT-PCR ）检测干扰效率。【结果】筛选出靶向牛SREBP1 基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了 pAd-1053 和阴性对照pAd-NC 重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053 和Ad-NC 高滴度病毒，测定得到的病毒滴度分 8 -1 8 -1 别为7×10 GFU·mL 和9×10 GFU·mL 。Ad-1053 和Ad-NC 分别侵染牛前体脂肪细胞，qRT-PCR 检测结果显示Ad-1053 可显著降低SREBP1 基因的mRNA 水平（干扰率＞85% ），而Ad-NC 对SREBP1 基因表达无明显影响。【结论】成功筛 选得到靶向干扰牛SREBP1 基因的有效shRNA，并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。 关键词：牛；SREBP1；shRNA；重组腺病毒 Selection of Effective SREBP1 shRNA in Cattle and the Construction of Recombinant Adenovirus Vector 1 1,2 1 1,2 1,2 FU Chang-zhen , ZAN Lin-sen , WANG Hong , CHENG Gong , WANG Hong-bao , 1 1 1 1 LI Yao-kun , JIANG Bi-jie , GAO Jian-bin , YANG Ning 1