基于1H NMR技术的乳热奶牛血清代谢组学分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(2):362-369 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.16 1 基于 H NMR技术的乳热奶牛血清代谢组学分析 孙雨航，许楚楚，李昌盛，夏 成，徐 闯，吴 凌，张洪友 （黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319 ） 摘要：【目的】应用1 1 H 谱核磁共振（ H NMR）技术筛选乳热奶牛血清内差异表现的小分子代谢物，从小分子 水平和物质、能量代谢的角度探究奶牛发生乳热时其体内的代谢变化。【方法】选取年龄、胎次、体况和泌乳量相 近的分娩当天的荷斯坦高产奶牛共 32 头，根据其血清中钙离子浓度及其有无临床症状分为两组。其中，24 头奶 牛为健康对照组（Group1, 血钙浓度 2.5 mmol·L-1 ，无其他任何症状）和8头乳热组（Group2, 血钙浓度 1.4 mmol·L-1 ，伴有明显乳热临床症状）。32头奶牛分别于清晨饲喂和榨乳前从颈静脉采集血液10 mL，置于离心管中， 4℃下以1 500 × g 离心20 min，将离心得到的血清装入1.5 mL的EP管中，置于-80℃下待测。待样品解冻后， 分别从每个EP 管中抽取400 μL血清，加入200 μL缓冲盐溶液，充分混合、离心后，提取550 μL上清液置于5 mm 核磁管中，在 500 MHz 的核磁共振波谱仪下采集信号。然后利用 Topspin 和 MestReNova 等软件将采集到的信 号进行傅里叶转换，同时进行调零、校正基线和相位等预处理，去除水峰和尿素峰信号，将一维图谱进行积分分 段，并将图谱信息转换为 TXT 格式文件，以便于后续数据分析，然后使用 Chenomx 软件进行化合物指认。最后应 用SIMCA-P软件对得到的图谱数据进行多元统计分析，包括主成分分析（PCA）和正交修正-偏最小二乘法-判别分 析（OSC-PLS-DA）， 同时结合SPSS软件对核磁数据进行单因素方差分析得到的P值以及Loading图，最终筛选出 表现差异的小分子代谢物。【结果】本试验成功得到了乳热组和健康对照组奶牛的血清代谢图谱及差异表达代谢物 的 Loading 图；PCA 结果显示每组样品均在 95%置信区间内，无需剔除，主成分贡献率较低，其中 PC1=26.2%， PC2=16.7%，组间差异变量不能被选择；OSC-PLS- DA结果显示经过5次正交信号修正，与分组无关的变量被去除， 组间差异达到最大化；与健康对照组相比，共筛选出 9 种血清差异表达代谢物，其中 4 种表达上调，分别为 β- 羟基丁酸、丙酮、丙酮酸和赖氨酸，5种表达下调，分别为葡萄糖、丙氨酸、丙三醇（甘油）、磷酸肌酸和氨基丁 酸；9 种差异代谢产物多为糖和氨基酸，相互之间形成了一个能量转化网络图，通过多种代谢途径参与了机体能 量代谢过程，其中较为特殊的差异代谢产物，如磷酸肌酸可直接为机体提供能量，其表现降低可能与病牛肌无力 和瘫痪有关。此外，本试验中乳热组奶牛氨基丁酸降低，临床表现为精神沉郁、甚至昏迷，这与人类抑郁症患者 1 的氨基丁酸表现相吻合，有关氨基丁酸下降与奶牛乳热精神的关系有待研究者进一步证实。【结论】H NMR技术能 够被应用于筛选奶牛血清表现差异的小分子代谢物，代谢物差异显著；本试验中乳热奶牛血清差异代谢产物表现 出能量负平衡及脂肪动员的病理学特征，提示乳热与能量代谢障碍有关。 关键词：奶牛；乳热；代谢组学；1H核磁共振；能量代谢障碍 1H NMR-based Serum Metabolomics Analysis of Dairy Cows with Milk Fever SUN Yu-hang