基于DGGE和T-RFLP分析采食不同粗饲料梅花鹿瘤胃细菌区系.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(4):759-768 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.016 基于DGGE 和T-RFLP 分析采食不同粗饲料梅花鹿瘤胃细菌区系 1 2 1 1 1 1 1 李志鹏 , 姜 娜 , 刘晗璐 , 崔学哲 , 荆 祎 , 杨福合 , 李光玉 1 2 （中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子重点实验室，长春 130112； 农业部环境保护科研监测所生态农业研究室，天津 300191 ） 摘要：【目的】细菌区系在梅花鹿（Cervus nippon ）瘤胃发酵中发挥着重要作用，然而有关梅花鹿瘤胃细菌 区系的研究鲜有报道。研究梅花鹿瘤胃细菌区系，为梅花鹿瘤胃发酵调控提供分子生物学依据。【方法】选取4 头 2 岁龄的装有永久性瘤胃瘘管的成年雄性梅花鹿为研究对象，分别饲喂以柞树叶（OL 组，梅花鹿A 和B ）和玉米 秸秆（CS 组，梅花鹿C 和D ）为主要粗饲料的日粮，持续饲喂30 d。通过瘤胃瘘管取瘤胃内固液混合物，提取瘤 胃微生物基因组DNA。扩增瘤胃细菌16S rRNA 基因V3 区以及16S rRNA 基因，分别用于DGGE 和T-RFLP 分析。DGGE 图谱进行聚类分析，并切取优势条带进行克隆测序，鉴定瘤胃内细菌组成。根据T-RFLP 图谱结果计算细菌群落的 多样性、优势度、均匀度和丰富度，通过Microbial Community AnalysisⅢ（MiCAⅢ）数据库推测T-RFs 可能代 表的微生物种类，并进行T-RFLP 图谱的聚类分析。【结果】DGGE 图谱聚类表明，CS 组和OL 组瘤胃细菌区系相似 性低于65%，表明粗饲料种类影响梅花鹿瘤胃细菌区系。OL 组梅花鹿A 和B 的DGGE 图谱相似度大于70%，CS 组梅 花鹿C 和D 的DGGE 图谱相似性大于75%，而且同组不同个体之间瘤胃细菌区系存在差异。OL 组和CS 组分别获得 20 和24 个DGGE 特异性条带。序列分析表明，CS 组条带可归类为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，而OL 组条带 可归类为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和互养菌门。OL 组与 CS 组中存在大量 Prevotella spp.，但不同组中 Prevotella spp.在种水平组成不同，主要纤维降解菌为Clostridium spp.与Eubacterium spp.。T-RFLP 结果显 示，梅花鹿D （CS 组）具有最高的丰富度、多样性、均匀度和最低的优势度，梅花鹿A 和B 的各项指数相近但低 于梅花鹿D，说明OL 组中的粗饲料（柞树叶）影响瘤胃中微生物的相对生物量。梅花鹿C 和D 的各项指数相差较 大而且梅花鹿C 的指数低于梅花鹿A 和B，表明同组不同个体之间存在差异。81、214、272 和308 bp 的T-RFs 为 OL 组优势条带，90、95、175、273 和274 bp 的T-RFs 为CS 组优势条带，161、259、264、266 和284 bp 的T-RFs 为共同条带。根据MiCAⅢ结果，这些T-RFs 代表细菌归类于拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和酸杆菌门。T-RFs 图谱聚类表明，4 头梅花鹿T-RFs 聚为两类，粗饲料来源影响梅花鹿瘤胃细菌T-RFs 图谱特征，其中梅花鹿A、B 和C 的T-RFs 特征条带图谱相似。【结论】Prevotella spp.是梅花鹿瘤胃优势细菌，但不同粗饲料影响梅花鹿瘤 胃细菌区系组成。 关键词：梅花鹿; 细菌区系; 普雷沃氏菌; 单宁 Analysis of Bacterial Diversity in Rumen of Sika Deer (Cervus nippon) fed Different Forages Using DGGE and T-RLFP 1