欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达.pdfVIP

中国农业科学 2011,44(23):4848-4857 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.23.011 欧李八氢番茄红素合成酶cDNA 克隆、序列分析 及在大肠杆菌中的功能表达 张建成，杜俊杰，刘 和，王鹏飞，薛晓芳，穆霄鹏，陈俊奇 （山西农业大学园艺学院，山西太谷030801 ） 摘要： 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis （Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase， PSY）基因，并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA 为模板，通过RT-PCR 扩增到PSY cDNA 中间片段，再利用RACE 技术获得该基因 cDNA 全长并分析其序列；然后利用PCR 技术获得欧李 PSY cDNA 编码区全长，将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)，获得重组质粒pET-ChPSY，转化大肠杆菌BL21 （DE3） 诱导表达，并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY 的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA 全长1 559 bp，最大 开放读码框为 1 194 bp，可编码398 个氨基酸，命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物 PSY 核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上，并且发现欧李PSY 的N 末端存在1—55 个氨基酸残基 组成的转运肽信号序列，在37—58 和219—240 氨基酸区域包含2 个跨膜结构域。SDS分析表明，原核表达 获得了具有较高表达水平的融合蛋白 6×His-PSY，相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY 可编码一个功能蛋白，促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。 【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA 全长并 在大肠杆菌中功能表达，为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。 关键词：欧李；八氢番茄红素合成酶；克隆；功能表达 Molecular Cloning，Sequence Analysis of Phytoene Synthase Gene from Cerasus humilis (Bge) Sok. and Its Functional Expression in E.coli ZHANG Jian-cheng, DU Jun-jie, LIU He , WANG Peng-fei, XUE Xiao-fang, MU Xiao-peng, CHEN Jun-qi (College of Horticulture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi) Abstract: 【Objective 】The present study aimed at cloning and analyzing the phytoene synthase (PSY) gene from Cerasus humilis (Bge) Sok. and verifying its catalytic function by heterologous expression in E. coli containing a β-carotene producing plasmid. 【Method 】Using the total RNA from the fruit of C. humilis (Bge) Sok. as the template, the cDNA specific fragment of PSY gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and then the