精子介导的转基因效率关键影响因素.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(20):4086-4095 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.20.017 精子介导的转基因效率关键影响因素 焦明霞，牟彦双，格日乐其木格，张琳琳，孔庆然，付海鹏，刘忠华 （东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030） 摘要：【目的】精子介导的转基因技术简单易行，其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认 同。但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低，转基因效率差异极大。现将主要探讨导致这种现象 的原因。【方法】小鼠精子获能后分别与 0、15、30 和 300nmol·L-1 的 Cy-3 标记 DNA（Cy-3-DNA）在 37℃共孵育 30 min。其后，血细胞计数板检测小鼠精子的活率；共孵育精子进行直接涂片，DPBS洗涤后涂片，DnaseI消化后 涂片，精子涂片置于荧光显微镜下，记录视野中的精子总数及显示Cy-3信号的精子数，用于统计精子结合及内化 -1 -1 DNA的效率。精子与300 nmol·L 的Cy-3-DNA共孵育后，以50µmol·L 的 P 诱导精子顶体反应，统计顶体反应前 4 后显示Cy-3信号的精子比例。精子分别与15和300 nmol·L-1 Cy-3-DNA共孵育后，精子进行体外受精，在荧光镜 下观察合子期受精卵中 Cy-3-DNA 的存在位置。按照优化后的条件，精子分别与 0、15 和 300 nmol·L-1 pEGFP-C1 质粒共孵育后进行体外受精，制备转基因胚胎。比较试验组和对照组的受精率和发育效率，采用PCR和RT-PCR方 法检测囊胚期外源基因整合和表达情况。【结果】获能后的精子分别与 0、3、15、30 和 300 nmol·L-1 的 Cy-3-DNA 共孵育后，精子的活率分别为 82.21%、73.63%、77.38%、76.33%和 77.80%；洗涤前精子结合 DNA 的效率分别为 -1 -1 76%、94%、99%和100%，15、30和300 nmol·L 组精子结合率均显著高于3 nmol·L 组（P＜0.05）。洗涤后精子结 合 DNA 的效率，分别为 45%、66%、84%和 87%，消化后精子内化 DNA 的效率分别为 44%、56%、71%和 76%，并且洗 -1 -1 -1 涤后精子结合及消化后精子内化DNA的效率都为300 nmol·L 组和30 nmol·L 组均显著高于其他两组，而15 nmol·L -1 组显著高于 3 nmol·L 组（P＜0.05）；Image J 对精子结合 Cy-3-DNA 的强度进行分析的结果表明，外源 DNA 的量 随着外源 DNA 浓度的增加而显著增加（P＜0.01）。顶体反应后，精子顶体部 DNA 会有丢失，但精子头部后区的外 源 DNA 依然会保留，因此，顶体反应前后，精子结合外源 DNA 的精子比率没有降低。15 和 300 nmol·L-1 DNA 共孵 育的精子体外受精后，荧光显微镜下检测显示，合子期胚胎有外源 DNA 的荧光信号分布，将荧光信号在雄原核附 近密集的胚胎记为阳性胚胎，300 nmol·L-1 DNA 共孵育的精子获得合子期胚胎的阳性率为 27.89%，显著高于 15 nmol·L-1 组的9.00%（P＜0.05）。精子与pEGFP-C