抗性稗草1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的克隆与表达分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(20):4077-4085 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.20.009 抗性稗草1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的克隆与表达分析 1,2 2 2 2 1 董明超 ，杨 霞 ，张自常 ，李永丰 ，管荣展 1 2 （南京农业大学农学院，南京 210095 ； 江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014 ） 摘要：【目的】克隆稗草（ Echinochloa crus-galli ）乙烯生物合成途径关键酶 1-氨基环丙烷-1-羧酸氧 化酶基因（EcACO ），对其进行表达分析和酶活性测定，以探究稗草抗二氯喹啉酸的机理。【方法】根据转录组 测序所得 EcACO 部分序列设计引物，分别从二氯喹啉酸的抗性和敏感型稗草中克隆 EcACO 的全长序列，用 DNAman 以及 GeneDOC 等软件进行序列分析。用 qRT-PCR 方法分析抗性和敏感性稗草间的 EcACO 表达水平差异。 最后分别将抗性和敏感性稗草 EcACO 的开放阅读框（ORF）序列连接至原核表达载体 pMAL-c5x 中，并转化至 大肠杆菌菌株 BL21，经终浓度为 0.4 mmol·L-1 的 IPTG 于 18℃诱导 16 h 后，检测 EcACO 蛋白的表达情况。采 用 MBP 吸附柱分离纯化 EcACO 蛋白后，通过测定乙烯释放量，测定抗性和敏感稗草 EcACO 蛋白间的活性差异。 【结果】克隆得到抗性稗草和敏感稗草EcACO，其编码区序列长度为 936 bp，预测蛋白含 311 个氨基酸残基， 蛋白分子量大小和理论等电点分别为 35 kD 和 5.4。序列比对表明，抗性稗草 EcACO 氨基酸序列与粟（ Setaria italica）、玉米（Zea mays ）、高粱（Sorghum bicolor ）同源性分别为 93%、92%和 91%；与敏感性稗草 EcACO 相比，抗性稗草 EcACO 的氨基酸序列存在 5 个突变位点，其中有 3 个突变位点位于保守功能域上。qPCR 分析 显示，EcACO 在抗性和敏感性稗草中并无明显的表达水平差异。原核蛋白表达和酶活性测定结果表明，敏感 型稗草 MBP::EcACO 融合蛋白单位时间内产生的乙烯释放量是抗性稗草 MBP::EcACO 融合蛋白的 2.15 倍，因而 该基因可能解释了稗草的抗药性机理。【结论】从抗二氯喹啉酸的稗草中克隆了EcACO，发现了与抗性相关的 5 个氨基酸突变位点，其中的 3 个位点突变位于保守结构域，这可能是引起乙烯释放速率降低以及稗草产生 二氯喹啉酸抗性的原因。 关键词：稗草；1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶；基因克隆；点突变；表达 Identification and Expression Analysis of 1-Aminocyclopropane- 1-Carboxylate Oxidase Gene from Quinclorac-Resistant Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli) 1,2 2 2 2 1 DONG Ming-chao