小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(2):370-380 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.17 小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析 1,2 1 1 1 2 1 秦加敏 ，罗术东 ，廖秀丽 ，黄家兴 ，和绍禹 ，吴 杰 1 2 （中国农业科学院蜜蜂研究所/农业部授粉昆虫生物学重点实验室，北京 100093； 云南农业大学东方蜜蜂研究所，昆明 650201 ） Bombus hypocrita ）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase，Tre-1 ）全 摘要：【目的】克隆小峰熊蜂（ 长cDNA序列，预测该基因及其编码蛋白的理化性质，明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性， 为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（ B. terrestris ）和 B. impatiens 可溶型海藻糖酶基因 Tre-1 编码蛋白的保守区序列，利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保 守区片段；随后根据该片段设计基因特异性引物，用RACE方法获得5端和3端片段。在此基础上，根据RACE扩 增所得片段和保守序列，预测开放阅读框（ORF）序列，分别在起始密码子近5端和终止密码子的近3端设计ORF 区特异性引物扩增得到ORF，最后采用BioEdit软件比对、拼接获得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全长序列。运用ExPASy、 SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0 等软件对该基因进行生物信息学分析，并利用实时荧 光定量 PCR 技术，采用 2-ΔΔCt 方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆 所得基因cDNA 全长为3 129 bp，命名为 BhTre-1 （GenBank登录号：KJ025078），其中包含5端441 bp 非编码区 和 3端 945 bp 非编码区，ORF 为 1 743 bp，共编码 580 个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为 67.16 kD，等 电点为5.95；有1个信号肽结构 （1—21位），1个甘氨酸富集区（GGGGEY），2个特色 “标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY 和 QWDFPNAWPP），6 个 Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列，无跨膜区。序列分析发现 BhTre-1 氨基酸序列与地熊 蜂 BtTre-1 和 B. impatiens BiTre-1 的一致性很高，分别为 99%和 98%，与西方蜜蜂（Apis mellifera ）和云南 小蜜蜂（A. florea ）的Tre-1 一致性也达到 78%；系统发育分析也表明 BhTre-1 与 BtTre-1、BiTre-1 的亲缘关 系最近，与 AmTre-1、AfTre-1 之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示 BhTre-1 在成虫被检测的各组织中均 有表达，在中肠的表达量最高，其次是马氏管，其他各组织表达量较低。成年工蜂的 BhTre-1 表达量高于幼虫和 蛹，工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律，在第 15 天表达量最高。【结论】克隆得到了 BhTre-1 全长cDNA序列，其分子生物学特性与其他昆虫 Tre-1 相似，该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高，此外， 幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂，工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势，为进一步研究该基因在小峰熊蜂 体内的生物学功能奠定了基础。 关键词：小峰熊蜂；可溶型海藻