利用体细胞核移技术生产表达α-乳清蛋白的转基因山羊.pdfVIP

摘要 通过体细胞克隆技术生产转基因山羊，进而创制山羊乳腺生物反应器、培育山羊 转基因育种新材料， 在医疗、 畜牧业上均具有广阔的应用前景。 本文围绕着建立有效、 经济的山羊转基因克隆技术平台，针对山羊卵母细胞体外成熟与 alpha­乳清白蛋白转 基因克隆山羊研制的关键技术环节，开展了如下试验： 试验一：总结统计了本地区不同月份从屠宰场所取得的卵巢，每个卵巢可获得的 有效卵母细胞数，以及本地区不同月份对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：10  月份、11月份、12月份和 1月份每个卵巢采集到的可用卵母细胞平均数量较高，分 别为：1.957、1.938、1.804和 2.525枚，其中 3、4、5、6、10、11、12月份之间差 异不显著，1月份与 3、4、5、6 月份差异显著，1月份与 10、11、12 月份差异不显 著；10月份、11月份、12 月份和 1月份卵母细胞成熟率也较高，分别为：55.37%、  53.74%、56.61%、55.71%，其中 3、4、5、6、10、11、12月差异不显著，1月份与  3、4、5、6 月份差异显著，1月份与 10、11、12月份差异不显著。总体来说，秋冬 季节左右采集的卵巢相对于其它月份，数量和质量都较好。说明本地区 1月份、10  月份、11月份和 12 月份卵巢的采集和卵母细胞的成熟都比较好，适合试验取材。 试验二： 探索卵母细胞成熟培养基中添加维生素 C （Vc） 对卵母细胞成熟的影响。 结果表明：添加 500µM、1000µM 的 Vc 组成熟率均显著高于对照组（P＜0.05）。其 中，添加 1000µM 的 Vc 组成熟率最高为：68.18 %。因此，在成熟培养基中添加浓 度为 1000µM 的Vc 对卵母细胞成熟有明显的促进作用。 试验三：探讨卵母细胞成熟培养基中添加人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF） 对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：试验组成熟率、卵母细胞孤雌后胚胎卵裂率 都比对照组高，不过差异均不显著（P＞0.05）。添加 50ng/mL  的 hbFGF 组成熟率为  70.43 %，卵裂率为 68.49 %，效果最好。因此，适宜浓度的hbFGF 可促进山羊卵母 细胞的体外成熟及后期发育。 试验四：比较了不同融合参数对重构胚融合率的影响。结果表明：参数为  1.40  kv/cm、30μs  、2DC  ， 更能有效地融合重构胚， 融合率为 68.99 %。 其中， 与 1.40 kv/cm、  30μs、1DC，120 kv/cm、30μs、2DC组差异不显著；与 120 kv/cm、30μs、1DC 组显 著差异。 试验五：通过克隆小鼠 α–乳清蛋白 （α–lactalbumin）cDNA 为目的基因，以改造 好的载体 PBC1­Neo 为骨架，构建了 PBCI­N­Lact 乳腺特异性表达载体。酶切和测序 结果表明：成功克隆了  α–乳清蛋白基因，并在载体骨架上得到正确表达。通过脂质 体转染，成功获得携带该乳腺表达载体的阳性山羊胎儿成纤维体细胞。 试验六：通过以上五个试验的准备和摸索，为生产转基因山羊建立了相对稳定的 I 平台。以带有  α–乳清蛋白基因的黄淮白山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞，利用体 细胞核移植方法，生产了约 220 枚胚胎。分别移植到 10 头受体山羊子宫中，怀孕足 月后，有 2 头小羊顺产。经鉴定，一头为转 α–乳清蛋白基因山羊，另一头为克隆山 羊。结果表明：成功利用体细胞核移植法生产了转基因山羊。 综上所述， 本试验室成功获得了国内首例携带调节山羊乳汁品质基因的转基因克 隆山羊，这标志着我省在转基因动物研究领域取得了重要突破。为探索建立自主知识 产权的转基因克隆技术，以及给下一步研制转人 α­LA基因的山羊奠定了基础。 关键词：卵母细胞成熟，重构胚融合，体细胞核移植，转基因山羊，生物反应器 II Abstract  The technology in health care and animal husbandry have broad application prospects,