双生病毒dna分子βc1基因的功能研究.pdf

摘要 双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链DNA病毒，已在多个国家 和地区的作物上造成毁灭性危害，且有逐年加重的趋势。卫星DNA分子一DNA9 是一些单组份双生病毒在自然寄主上引起典型症状所必需的致病相关分子。迄今 发现的所有DNAD分子在互补链都含有一个位置和大小保守的芦cJ基因，但其功 基因的功能进行了研究。 曲茎病毒(TbCSV)Y3513分子的口CJ基因，以Ni2+寸盯Aagarose亲和纯化了 分析，发现13C1蛋白能结合单和双链DNA，且随着蛋白浓度的增加结合能力增 大小、形式和序列特异性，表明其以序列非特异性方式结合DNA。 以TYLCCNV 皮细胞和sf21昆虫细胞中对13c1蛋白的亚细胞定位进行了研究。用基因枪法将 能在细胞核内和细胞质中积累，在细胞核中积累量较高。利用杆状病毒表达载体 融合蛋白定位于昆虫细胞的细胞核内。口c』基因不同长度缺失的突变体与GUS 融合后在洋葱表皮细胞中定位发现，含预测的核定位信号序列(NLS， 中精氨酸突变为丙氨酸的突变体在细胞质和核中分布均匀，暗示所预测的NLS 可能是13C1蛋白的一个功能的NLS。 以农杆菌介导的叶盘转化法将35S启动子驱动的TYLCCNV Y1013分子flCI 基因转化本氏烟和普通烟，共获得75个株系的转基因本氏烟和39个株系的转基 因普通烟。2种转基因烟草的部分株系都产生类似病毒侵染的曲叶等症状，PCR 和Southern印迹分析表明屈?，基因已整合入这些转基因烟草株系的基因组中， II 成正相关。表达功能丧失的pCl基因突变体的转基因烟草不产生任何症状，因而 pcl基因的表达直接诱导转基因植物产生类病毒病的症状。 RNA沉默是一种植物体内固有的抗病毒防卫反应，在防御病毒侵染中起重 与辅助病毒共接种时能增强抑制RNA沉默的能力，表明DNAB直接或间接参与 力。因而，与其它植物RNA病毒不同，双生病毒可能编码多个RNA沉默的抑 筋子。 Y1015突变体并构建了突变体的侵染性克隆，侵染性和致病性测定表明4个突变 体能系统侵染本氏烟但不诱导明显的症状，推测Y10pCl蛋白的C端区和含有预 测的NLS序列的中间区对诱导典型症状都是重要的。Southernblot测定表明，4 个突变体均能在本氏烟中长期存在和忠实复制，但在组织中的积累量远低于野生 型Y1013，表明13CI蛋白与YIOl3在组织中的积累有关。 Y1 DNA-B的存在。鉴定了7个与TbLCYNV 源性和密切的进化关系。 分离物复制蛋白(Rep)基因，部分TbCSVRep基因的融合表达产物是可溶性的， 4B亲和层析柱纯化了TbCSV 利用GST-Sepharose Rep融合蛋白并制备了抗体， 亚细胞分布和免疫胶体金标记定位研究发现TbCSVRep蛋白定位在感病烟草细 胞核内，为研究DNAl3的复制机理奠定了基础。 III 通过以上研究，基本弄清了双生病毒DNAIB分子厨?』基因的功能，为进一步 揭示DNAB分子参与致病的机理奠定了基础。 关键词： 因植物RNA沉默抑制子 Summary Geminivirusesarea virusescharacterizedtheir twinned groupofplant by unique acircular DNA cause particles，whichencapsidate Single—strandedgenome．They destructivediseasesin theworldandare as many