家蚕类胰岛素基bbx-b8的功能研究.pdf

家蚕类胰岛素基因BBX-B8 的功能研究 中文摘要 中文摘要 胰岛素/类胰岛素生长因子信号通路在所有多细胞有机体的生长和发育，繁殖， 抗逆性，新陈代谢和寿命等生物学方面扮演着重要角色。昆虫类胰岛素肽 （Insulin-like peptides ，ILPs ）种类多样，在脑和其它组织中由多基因家族编码并 表达，与脊椎动物胰岛素结构组成非常相似但功能却不相同。 家蚕为鳞翅目昆虫的模式种，家蚕蚕素（Bombyxin ，BBX ）是首次发现的昆 虫类胰岛素，拥有7 个（A～G ）家族38 个成员，是昆虫ILPs 功能研究的良好材 料。家蚕BBX B 族的B8 基因（BBX-B8 ），编码88 个氨基酸残基，在家蚕脑神经 分泌细胞高水平表达。业已明确，家蚕BBX 具有促进造血器官细胞增殖、参与糖 代谢、调控蓖麻蚕前胸腺的分泌活性。为进一步探讨 BBX-B8 基因的功能，采用 RNAi 和转基因技术，较系统地研究上调、下调BBX-B8 表达水平对家蚕生长发育、 抗逆性、化性、丝蛋白合成等方面的影响。在克隆BBX-B8 cDNA 的基础上，通过 RT-PCR 检测到了BBX-B8 在家蚕脑、卵巢、精巢、中肠、前部丝腺、马氏管、脂 肪体和胚胎等组织中有不同程度的表达，而翅原基、卵黄中未检测到 BBX-B8 的 mRNA ，表明家蚕BBX-B8 的表达具有组织特异性；Western boltting 测定结果显示， 5 龄3 d 脑组织中BBX-B8 水平较低，5 d 起明显上升。将体外转录合成的BBX-B8 dsRNA 腹注5 龄3 d 家蚕，sqRT-PCR 和Western boltting 检测结果显示，注射3 d 后脑中BBX mRNA 水平的下降程度依赖于dsRNA 的注射剂量，10 µg/头注射区脑 组织中BBX 水平下降约30% 。证实BBX-B8 dsRNA 对家蚕BBX 基因有表达抑制 效应。以此BBX-B8 RNAi 家蚕模型对BBX 功能的研究结果显示，5 龄3 d 注射 BBX-B8 dsRNA，蛹翅原基发育受阻，畸形翅增多，成虫脑的形态发育明显延缓； 注射2 d 后进行高温（40 ℃ 3 h ）和低温（4 ℃ 3 h ）冲击，化蛹率比对照区提高12.76%； 注射后禁食处理，饥饿状态下的化蛹率比对照区低9.29% ；注射3 d 后，血淋巴中 SOD 活性、T-AOC 分别提高 17.81%、41.86% ，而CAT 活性与对照无显著差异； 血淋巴中海藻糖和海藻糖酶的水平分别上升 12.68%和68.24% 。化蛹1d 后的蚕蛹 注射BBX-B8 dsRNA （10、15 µg/10 µL·头），其造卵量分别增加7.86%和12.62%。 将家蚕BBX-B8w （野生型）和BBX-B8m （改造型）基因克隆进昆虫非转座子 载体pIZT/V5-6His 中，构建转基因重组载体pIZT/V5-B8w 和pIZT/V5-B8m ，分别 I 中文摘要 家蚕类胰岛素基因BBX-B8 的功能研究 转化家蚕BmN 细胞，经Zeocin 筛选和分子生物学鉴定获得转化细胞B8w 和B8m ； 调查结果显示B8w 和B8m 的生长稍慢于正常BmN 细胞，对杆状病毒Bm-BacPAK6 的感染性B8w 和B8m 与正常BmN 细胞之间无明显差异。采用精子介导法将转基 因载体pIZT/V5-B8w 导入家蚕基因组，通过荧光筛选和分子生物学方法鉴定获得 了BBX-B8w 转基因家蚕。研究结果显示，转基因家蚕脑提取液促进除脑蓖麻蛹羽 化的活性高于正常家蚕的脑提取液；转基因家蚕的发育延迟2-8 d ，蛹体重减轻， 丝蛋白的合成能力下降，且对雄蚕的影响大于雌蚕；有5.56%~14.29%的转基因蛾 产下非滞育卵。提示 BBX-B8 是家蚕的一个重要的发育调节因子，影响蚕的组织 器官发育、化性、抗逆性、产卵量、个体大小、丝蛋白合成，承担多种独特的生 物学功能。 关键词 家蚕 BBX-B8 RNAi 转基因 功能