羊草胆碱单氧化（cmo）基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.pdfVIP

羊草胆碱单氧化酶(C啪)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 摘要 chinese)，又名碱草，为禾本科赖草属植物，是我国温带广泛分布的 羊草(Leymus 禾草。羊草适应性强，属广生态幅植物，能耐旱、耐寒、耐盐碱、耐湿。虽然不是典型 的盐生植物，但它具有一定的耐盐碱性，在土壤盐分总量0．1～0．14％、pH8．3～8．9、碱 化度13．5～40．9％的生境上都能正常生长。 迅速合成并积累大量小分子化合物来维持细胞的正常功能是植物在受到盐碱或其 它环境胁迫时，对外界的一种适应性防御反应。甜菜碱便是这类相溶性小分子有机物中 重要的一种。在盐分胁迫下，许多植物特别是黎科和禾本科植物细胞中大量积累甜菜碱， 可提高细胞渗透调节能力，稳定细胞内大分子蛋白质和生物膜的结构与功能。在羊草中 也已测出有甜菜碱的积累。高等植物中，甜菜碱的合成都是由胆碱起始，经过两步催化 反应完成的： 胆碱单氧化酶 甜菜碱醛脱氢酶 胆碱 甜菜碱醛 甜菜碱 (CMO)(BADH) 催化第一步反应的酶是胆碱单氧化酶(choline 合成过程中的限速酶。CMO基因是目前耐盐、耐旱基因工程中研究得较多的基因之一。 从禾本科植物水稻、玉米等植物中已经分离出该基因，但在羊草中尚未见报道e 本实验以羊草为材料，根据GerSank中已注册的黎科和禾本科植物胆碱单氧化酶基 因序列，利用口血n盯5．O在保守区设计兼并引物进行RT．PcR扩增，获得520bp特异条带。 将PCR产物目的片段回收，克隆至T．载体，转化DH．5a受体菌，获得重组质粒，重组质 粒经酶切和PCR鉴定后进行测序。测序结果经比对后与玉米和水稻同源性最高，证明获 列及中间片段上游一段序列进行重叠序列拼接，扩增己获得的片段cDNA序列全长，命 I和EcoRI特 名为：LcCMO。在该cDNA序列开放阅读框(ORF)两端分别设计含有BamH 异引物PLc-1和PL∞，用于原核表达载体的构建。已获得的羊草LcC^彻序列测序后，全长 同源性最高，在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分别为78．77％和86．54％。 菌中诱导表达，表达蛋白质分子量约为37kDa。 本实验首次从羊草中分离c脚基因，并在大肠杆菌中进行表达，旨在探讨植物耐盐 碱基因表达机理，为进一步筛选出耐盐碱基因，解释羊草抗盐碱的分子机制，植物基因 工程改造农作物和快速培育新的耐盐碱植物提供理论依据。 关键词：羊草，胆碱单氧化酶，克隆，大肠杆菌，诱导表达 II and inE．coliof analysis CloningExpression Choline Chinese ofLeymus Monooxygenase(CMO)Gene Abstraet ascribedto of Chinese namedalkali Gramineae leymus(ZemusChinese)，also grass，is plant in zoneofour isawide widelytemperate country．It ecologicalamplitudeplant,adapting Leymus。speeding variousenvironment as