荧光假单胞菌遗标记及工程菌生物安全性评价.pdfVIP

摘要 生防微生物良好的田间定殖、存活和生存竞争能力是稳定发挥防效的重要前 提，而对在环境中使用的活体重组微生物而言，其生存竞争能力是转基因生物安 全性评价关注的重要内容。近年来新型报告基因已成为研究微观与宏观生命现象 的有效工具，新的研究方法和技术的兴起也为探明工程菌的生物安全性提供了有 效手段。 行改造，构建了含荧光假单胞菌自身启动子PP303的中间质粒载体pGFP。然后利 用mini．Tn5转座子，通过接合转移，将两个带有不同启动子的绿色荧光蛋白基 因分别整合到荧光假单胞菌P303染色体上，获得了在488nm波长下发光稳定的 于质粒标记。此外还发现低温有利于GFP的表达。生长曲线测定结果表明P303m1 与P303生长特性无显著差别，遗传稳定性实验表明96小时绿色荧光蛋白基因稳 定性为100％。同时利用电击转化方法获得含有Bt杀虫蛋白基因的三价荧光假单 胞菌工程菌BioP8，室内生测数据表明对小菜蛾毒力较高。室内平板抑菌试验结 萝b褐腐、油菜立枯、油菜菌核、黄瓜炭疽、烟草赤星青霉等植物病原真菌有较 强的拮抗作用。 利用微生物选择性分离培养技术和PCR鉴定方法，研究了P303、P303ml、 BioP8菌株在非限菌环境下不同生境的生存竞争能力：在温室自然土壤中，40 天内供试菌株群落总量基本维持在104～106CFU／g土(湿重)之间，土壤中可培 30天以内供试菌株 养细菌总量在108CFU／g土(湿重)左右；在大白菜根际， 叶片维持一段时间(第5．15天)，叶面可培养细菌总量在103．106CFU／cm2叶片 之间波动。P303及其工程菌株在温室自然土壤、田间大白菜根际和叶面的定殖 时间至少分别为60、50和15天，工程菌株生存竞争能力弱于天然菌株，它们的 消长动态相似，一个生长季(120天)后没有检测到长期残留或重组质粒扩散， 表明工程菌株具有良好的安全性。研究发现供试菌株在温室自然土壤、田间大白 菜根际的定殖能力明显强于叶面，BioP8定殖能力弱于出发菌P303。 建立了_套有效提取土壤、叶面细菌总DNA的方法，土壤总DNA提取量 16SrDNA V6可变区进行扩增，然后进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，结果表 明土壤、叶面的微生物群落表现出一定的多态性。 关键词：荧光假单胞菌；遗传重组生物；定殖：绿色荧光蛋白：交性梯度凝 胶电泳；安全性评价 Genetic assessmentof markingofPseudomonasfluorescetl$andbiosafety strain engineered insectsand biocontrol pests Zhangxia,Agricultural ProLLi ProfiChen Guoxun，Assosiate Supervisedby Zhongyi Abstract Itisthe forbiocontroleffectthatbiocontrolmicrobeCallcolonize． precondition of is surviveand1iveweiIinthefields．Thesurvivalrecombinant one