荧光假单胞菌工菌环境释放后的分子生态学分析和安全性评价.pdf

摘要 本研究中通过比较四种土壤样品总DNA的提取方法，确定了以提取成本较低、 提取效率较高(3，15mgDN削g十)、提取质量最适于偶联后续DGGE技术的土壤样品 总DNA的提取方法作为本研究中土总DNA的提取方法：即士壤样品颈处理，土壤 样品总DNA的糨提取，土壤样品总DNA的纯化；然后以纯化后的土壤总DNA为模 板进行细菌】6SrDNAV3区扩增；接下来采用微生物分子生态学手段的变性梯度凝 胶电泳技术(dellatu—ng舯dientgel 察法和DGGE图谱聚类分极的方法对荧光假单胞菌工程菌株BioP8和分别在基因缓 和质粒上带有红包荧光蛋白标记(啦，)的荧光假擎胞菌8’P303和12P303在进入土壤 中后的微生态行为进行了跟踪监测和分析。研究中未发现荧光假单胞菌工程菌株 Bi0P8和分别在基因组和质粒上带育红色荧光蛋白标讽(咖)的荧光假单胞菌8’P303 和12P303对土壤中细菌群落组成和结橡产生明显的可检测得到的影响。从DGG嚣图 谱上几乎观察不到空白对照主壤样品与喷施了相应菌液的±壤样品有差别；结合 Matlab ImageJ，Ma{hworksV7．1以及PAsT软件对DGGE图谱进行聚类分析：在喷施 了荧光假单胞菌工程菌株BioP8的处理土壤的．DGGE图谱上，第7天、第15天和第 45天的空白对照土壤样品和经荧光假单胞菌工程菌BioP8处理的土壤样品分别聚在 一起，细菌群落组成相似性大约在88％左右；丽第O天与第{天的4份土壤样品聚在 一起，第30天与第45天的4份土壤样品聚在一起，第60天与第90天的4份士壤样 品聚在一起。由此可以看出，取样时问相对应的空白对照土壤样品与喷施了荧光假单 胞菌工程菌BioP8的土壤样品细菌群落组成相似性在85％点右；而纵向对问上的差别 也不是很大，其相似性程度也在70％以上；在8’P303的处理的DGGE匿港上，主要 了基因组带有红色荧光蛋白标记的荧光骰单胞菌8’P303的土壤样品，各个样品之间 的细菌群落组成相似性均在80％左右；第二个clustcr主要包括第30天和第45天的 土壤样品，其细菌群落组成相似性在90％左右；第三个cluster主要包括第60天手眭第 90天的±壤样黠，其细菌群落组成相似性在80％左右，所有±壤样品细菌群落组成 相似性也可达到∞％以上；在12p303的处理的DGGE图谱上，第O天到第15天的 包括空白对照土壤样品和喷施了带有红色荧光摄自质粒标记的荧光假单胞菌12P303 的土壤样品均聚在一起，细菌群落组成相似性约为80％；第30天和第45天的样品聚 在一起，细菌群落组成相似性约为8S％；第60天和第90天的样品聚在一起，细菌群 落维成相似性也达到80％。由此可见，对于荧光假单脆菌工程菌以及带有红色荧光蛋 自标记的荧光假单胞菌，从微生物分子生态学角度评价，二者均具有良好的生态安全 性，可以进行大规模的环境释放和田间应用。本研究采用微生物分子生态学手段为荧 光假单胞菌工程菌的产业化和生产应用提供真接的科学依据，具有重要的理论意义和 实践价值。 关键词：生态安全性；微生物分予生态学；荧光假单胞菌工程藏；变性梯度凝胶 电泳；聚类分析 Ass髂smen|of Molec珏18r and G赚醛icallyEngineered Bi。safety EeoIogyAnaIysis ReleasedinlheFields 5滩ralns ．尸$P甜l如m口肆甜s．，跏pr|蝤斓s AuthofZhou1in Profcssorand Professor zhangjie supenisor：Li(沁oxun M andPestCon渊 a