养殖沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法的建立.pdfVIP

第 35卷 第 3期 渔 业 科 学 进 展 Vo1．35．No．3 2014年 6月 PR0GRESSINFISHERY SCIENCES Jun．，2014 养殖沉积环境 中气单胞菌属细菌的 实时荧光定量 PCR检测方法的建立 姜娓娓 李秋芬 刘淮德 李晓龙 ( 中国海洋大学海洋生命学院，青岛266003) (农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛266071) 摘 要 利用 C,yr8基因的特异性引物建立沉积环境 中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测 方法。将 已知浓度的气单胞菌茵液加入灭菌的沉积物样品中，作为模拟沉积物样 品。通过选择和优 化沉积物DNA提取方法、特异性引物、标准曲线模板，建立沉积环境中气单胞茵属细菌准确检验的实 时荧光定量 PCR方法，同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明，采用改进 的溶菌酶． SDS温和裂解法提取沉积物 DNA，以扩增 培基因片段的IAF和 IAR为特异性引物，并直接 以模拟 沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线，可以建立适用于定量检测沉积环境 中气单胞菌属细菌的实 时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘底泥中气单胞菌属中不 同种的细菌，检 出效率可达 10 CFU／g。统计分析显示，变异系数为0．21％ 一0．80％，均小于5％，表 明重复性 良好。 关键词 GyrB基因；沉积环境；气单胞菌属；实时荧光定量 PCR 中图分类号 Q939．96 文献标志码 A 文章编号 1000-7075(2014)03-0126-08 Establishmentofthereal·timefluorescentquantitativePCR methodfor detectingAeromonasinsedimentenvironmentofaquaculture JIANGWei—wei LIQiu—fen LIUHuai．de LIXiao—long (CollegeofMarineLifeSciences，OceanUniversityofChina，Qingdao266003) (KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries，MinistryofAgriculture； Yellow SeaFisheriesResearch Institute，ChineseAcademyofFisherySciences， Qingdao266071) ABSTRACT Aeromonasisoneofthepathogenscausing skinulcersyndromein cultured os— tichopusjaponicas．Itisimportanttomonitorthepopulationofthesebacteriainthecultureenvironment fordiseasecontro1．Unfortunately．currentreal—timequantitativePCR detectionmethodiSmostlvbased onthepurecuhureand cannottrulyreflectthebacteriapopulation in thesedimentenvironment ． Therefore，weestablishedareal—timefluorescentquantitati