利用Ap—PCR分子标记估测太空飞行中失重与离子辐射对甘草基….pdfVIP

维普资讯 ／ r 、 _)／／)宝19多98 Juurna]ofAgriculturalBiowchnologQ~ 。 6(4) 抛 弓 ： 一 利用Ap—PCR分子标记估测太空飞行中失重 与离子辐射对甘草基因组的影响(简报) 塑 壹 重： 淑平 薛 岚?权丽辉z李文彬 孙勇如 肖培根z (1中国科学院遗传研究所。北京 lOOl01；2中国医学科学院和协和医科大学药用植物研究所。北京 100094) 随着经济的发展，太空开发研究越来越受到世界广泛关注。失重和离子辐射 已被普遍认为是太空 飞行中影响测试生物的二大主要因素，本研究旨在研究失重与离子辐射 ／失重二个因素对太空飞行甘 草的基因组的影响效果。 Ap—PCR或稚RAPD，仍然是 目前应用最为广泛的分子标记 。尽管几年来有关RAPD缺陷的报道 也较多，主要是在不同实验室之间、PCR仪之间及DNA聚合酶(Taq酶)之间ApPCR结果常有不一 致的表现 ，但是，通过适当控制影响Ap—PCR稳定性的因素，重复几次实验 ，同时忽略那些不稳定及 模糊的条带，Ap—PCR仍然不失为一种测定基因组变异的有用工具 。为此，本研究利用 Ap—PCR分子 标记来估测太空飞行甘草的基因组变异。 1 材料和方法 1．1 材料 甘草(GlycyrrhizaUrolensisFish)种子按Li等方法制成生物叠，后者装在小型生物舱内，于 1996 年搭载返地卫星，飞行 l5天。飞行期间设定地面对照，并确保对照种子存放处具有与太空飞行卫星舱 内相同的温度与大气组成条件。卫星回收后，种子按L 等方法经显微镜检测分析而分为失重组 (即未 受到离子辐射影响)和离子辐射 ／失重组。二组太空飞行种子与一组地面对照种子播种在中国医学科 学院药用植物研究所植物园中。通过表型观察，三组实验材料无明显差异，细胞遗传学研究表明它们 之间也没有发现染色体畸变(待发表)。65个随机引物，部分 由意大利米兰大学Sala惠赠，部分 由美国 O~ron技术公司台成。RNase、7 DNA聚台、PCR酶缓冲液、dNTP、DNA分子量标准购 自美国 Promega公司。琼脂糖购自美国Pharmacia公司，其它化学试剂为国产分析纯。 1．2 方法 1．2l 甘草基因组 DNA提取 从失重组、离子辐射 ／失重组及对照组中，分别取 l0个单株的新鲜 或一2OC保存的叶样(每单株约0．15g)，按常规方法消毒，消毒后的每组叶样混台并经液氮研至粉 未，尿素法提取总DNA，并电泳比较定量。 1．2．2 Ap—PCR反应与电泳鉴定 利用Perking—Elmer480PCR仪进行Ap—PCR反应。扩增按常规 反应体系进行，程序为：①94C预变性4min；②40个循环：94C变性 1min，47C退火 1min，72C 延伸 2min；③72C 保温 10min，确保引物延伸反应完全；反应完成之后，样品于4C或一20c存放， 或立即进行电泳鉴定。对于每个预筛选引物 (共用 6个)，除用 0．5、5及 50ng三种模板DNA(指每 组DNA)，还增加 1个至几个小于0．5ng或大于 5ong的模板DNA浓度，及一个不加模板DNA 的 对照，用匕上排除因模板DNA浓度不同所导致的不稳定性结果。对于每个筛选到的引物重复Ap—PCR 反应一次。电泳鉴定：从每个瓜管中取 10J1L反应产物，与2 L溴酚兰(6×母液，含：0．25 溴酚兰， 40 蔗糖水溶液)于--d,片干净的Paraffilimfffy的封 口膜上混匀，于含有 0．5~g／mL溴化已锭的2 琼脂糖平板凝胶中，1×TAE(0．04mol／LTris／HCI，0．001mol／LEDTA)缓冲液，在 5