重组子的筛选与鉴定资料.pptVIP

第七章 重组子的筛选与鉴定 第一节 遗传学检测法 第二节 核酸分子杂交检测法 第三节 电泳检测法 第四节 免疫化学检测法 第五节 核酸序列分析及其他方法 将目的DNA片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重组子导人宿主细胞。得到所需要的带有重组DNA的转化子是基因工程的目的所在。 转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。 在转化反应中，并非所有的细胞都转入重组DNA分子，即使所有的受体细胞都变为转化体，所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子，因为在连接产物中既有裁体和一个或数个串联目的基因的连接，也有载体的自连，还有目的DNA分子的自连，更多的是未发生连接反应的载体和目的DNA片段。 因此在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开。这就需要设计出容易于筛选重组子克隆的方案并加以验证，这就是我们这一章要讨论的内容。 阳性克隆的筛选与鉴定可以从不同的层次、利用不同的方法进行。总的来说，重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同的水平进行鉴定。 第一节 遗传学检测法 1 根据栽体表型特征的筛选 2 根据插入基因遗传性状的筛选 1 根据栽体表型特征的筛选 根据载体分子所提供的表型特征，选择重组体DNA分子的遗传选择法，可适用于大量群体的筛选，因此是一种比较简单而又十分有效的方法。 含有一个选择标记:实际操作中，最典型的方法是使用抗药性标记的插入失活作用，或是β—半乳糖苷酶基因的显色反应，将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来。 对λ噬菌体的置换型载体来说。λ噬菌体头部外壳蛋白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型λDNA长度的75％一105％之间 36—51kb ，这样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带有外源DNA的插入片段，λ噬菌斑的形成本身就是对λ重组体的一种筛选特征。 1.1抗药性标记及其插入失活选择法 在PBR322质粒上有两个抗生隶抗性基因， Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。 （1）四环素抗性插入失活 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。 1.2 ?-半乳糖苷酶显色反应选择法 1.2.1. 原理：载体上有一段?-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的?片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的?-半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的?-半乳糖苷酶。?-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点 MCS 区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。 2 根据插入基因遗传性状的筛选 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。 营养缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。例如．当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将该基因重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸合成酶的菌株存活。 第二节 核酸分子杂交检测法 1 原理 2 核酸杂交检测方法 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针。 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落 噬菌斑 或提取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交。菌落 噬菌斑 或DNA从平板或凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为印迹 blotting 杂交。 2.1 Southern blotting Southern印迹杂交是由E Southern于1975年首先建立并使用的，故名之。它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段。 Southern印迹杂交是