四种后睾科吸虫遗传多态性研究.pdfVIP

摘 要 本试验以台湾次睾吸虫(Metorchis anatis)、华支睾吸虫(Clonorchissinensis)及截形微口吸虫(Microtrematruncatum) 为材料，应用随机扩增多态性DNA技术对这四种后睾科吸虫基因组DNA进行 遗传多态性研究。试验采用改进的酚／氯仿法进行基因组DNA的提取，结果表 明所提DNA完整，没有断裂或降解，大小均在23．1kb左右，经DNA纯度鉴定 板、Taq酶、dNTP的浓度、退火温度及退火时间等影响因素进行梯度筛选，经 过反复的试验，确定了RAPD最佳扩增体系及反应程序。采用该扩增体系和程 序，在严格控制反应条件、规范操作，保证反应条件前后一致的前提下，获得 了稳定的、可重复的结果。试验从40条随机引物中筛选出20条多态性及重复 性好的引物，共扩增出310个DNA谱带，其中多态带为307条，多态率为99．03 ％。单个引物扩增片段数在6～23之间，扩增出的条带大小在202～2460bp之 间，扩增条带最多的引物是S22，为23条，最少的引物是$477，为6条。引物 传距离聚类分析。结果表明：鸭对体吸虫和华支睾吸虫的遗传距离为0．7944， 两者亲缘关系最近，最先聚在一起，截形微口吸虫与台湾次睾吸虫的遗传距离 最大，为0．9306，亲缘关系摄远。最后聚在一起，与传统分类结果基本一致。 关键词。RAPD遗传多态性台湾次睾嗳虫鸭对体吸虫华支囊吸虫穰形徽口嗳虫 前 言 寄生虫是自然界中普遍存在、种类繁多的一类生物群体。寄生虫分类的目的是找 出不同寄生虫之间的亲缘关系，追溯各种寄生虫演变的线索，从这种关系的参照对比中， 比较全面准确地认识和了解它们，并利用它们认识寄生虫与宿主之间的相互关系，了解 其对人和动物的危害，为临床医学、免疫学、流行病学的监控及防治策略的制订提供参 考。具体地说，了解寄生虫的分类系统，通过比较各类(种)寄生虫的生理学、生态学 以及其他各方面的个性和共性，才能比较全面地了解某类、某种寄生虫的本身。基于这 一目的，以形态学为基础的分类学显然是不够的，也不可能完成这一任务，因为形态仅 仅是演化过程留下的痕迹。当前寄生虫分类学的主要方面，仍然停留在形态分类学，甚 至是个体形态分类学的水平上。这样的分类具有很大的片面性和局限性，很难反映一个 种群的真正面貌，更不用说解释种问的亲缘关系，因而寄生虫分类系统很不稳定，同种 (物)异名和异种(物)同名非常多…。此外，在近缘种或中问种的分类鉴定。1、宿主 及地理环境等因素导致虫株的遗传变异的研究。1等方面，传统的研究方法的局限性也日 益明显。当前分类学正越过形态学的范围，进入生态学、生理学、发生学、免疫学、遗 传学、土壤学、气候学、地理学以及生物化学、分子生物学等领域。近年来，一些技术 如染色体技术”1’、同工酶‰““”、免疫组化陬”、电子显微镜m”、单克隆抗体技术卜5’ ”和分子生物学技术“…”相继应用于寄生虫的分类研究中。与其他方法相比，分子生物 学技术能直接反映基因本身的情况，显示出一定的优越性”’。目前用于寄生虫分类的分 子生物学方法如RFLP、SSR、DNA指纹图谱等都不同程度地存在操作繁杂、费用高昂、 费时、费力等缺点。而随机扩增多态性DNA技术(RAPD)以其简便、经济、快捷， 且无需事先了解物种的相关分子生物学信息等优点，一经报道即迅速渗透到基因组研究 的各个领域。在寄生虫研究上。RAPD技术亦广泛地应用于虫种的分类鉴定、亲缘关系 和系统发育研究、遗传学研究、寄生虫诊断以及流行病学的调查研究等方面“”“1。本 文拟就RAPD技术研究现状及其在寄生虫分类学上的应用作一概述。 1 RAPD在寄生虫分类学上的应用 1．1RAPD的原理及特点 1990年美国Du Pont公司的科学家Williams等“”以及美国加利福利亚生物研究所 AmplifiedPolymorphic DNA)。RAPD是以PCR为基础，利用随机的脱氧核苷酸单引物 对模板基因组DNA进行扩增，对于某一特定的引物，它同基因组DNA序列有其特定 kb范围内有与引物相匹配的反向互补序列 的结合位点，如果某一特定的序列在0，1～3 就可扩增出DNA片段。当基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就 可能导致这些特定位点分