拟态弧菌omp蛋白的黏附功能及其受体结合域的确定.pdfVIP

II 万方数据 摘要 拟态弧菌(Vibriomimicus，Vm) 是一种广宿主病原菌，可感染各种水产养殖动物 引起腹水病，严重威胁我国水产养殖业的健康发展。细菌黏附是病原菌引发感染的关 键起始步骤，其实质是细菌黏附素与宿主受体之间相互作用，使病原菌选择性地定植 于宿主细胞表面，继而生长繁殖，产生毒力因子或侵入深部，损伤组织细胞，导致疾 病的发生。从分子水平探明特定病原菌的黏附素及其关键功能域，设计和创制基于关 键功能域的新型黏附拮抗剂，是目前细菌性疾病防治的新策略。我们的前期研究结果 表明：拟态弧菌外膜蛋白U （OmpU）是一种较为保守的抗原蛋白，具有6个免疫优 B N OmpU 势 细胞线性表位，该蛋白 末端含有黏附素基序，抗 抗体可抑制细菌对人 源上皮细胞的黏附, 推测OmpU可能是拟态弧菌的黏附素。从前述重要的实验现象 出发，本研究以鲤鱼上皮瘤细胞(EpitheliomaPapulosumCyprinid,EPC)作为细胞黏附 模型，建立检测细菌或蛋白黏附特性的技术平台，确证OmpU蛋白的黏附功能，深 入解析其受体关键结合域，从而为创制新型黏附拮抗剂提供理论支持。主要研究内容 包括： 1拟态弧菌的黏附特性测定 以EPC细胞作为细胞黏附模型，建立检测细菌或蛋白黏附的技术平台，研究拟 态弧菌的黏附特性。结果显示拟态弧菌04-14菌株可聚集性地黏附于EPC细胞周围， 其最佳感染复数（MOI）为60，最佳黏附温度是28℃，最佳黏附时间为60min。胰 酶、蛋白酶K、半乳糖可完全阻断04-14菌株对EPC细胞的黏附，乳糖、蔗糖、葡 萄糖、甘露糖和麦芽糖对细菌的黏附活性无影响。结果表明拟态弧菌的黏附素为蛋白 质，与该黏附素相结合的受体结构中存在寡糖链，其中半乳糖残基决定其特异性。 OmpU基因荧光原核表达质粒的构建与表达 应用基因重组技术构建荧光原核表达质粒pET-32a-EGFP-OmpU，转化至E.coli Rosetta进行大量诱导表达，继而使用Ni-ChargedResin亲合层析柱纯化重组发光蛋白 EGFP-OmpU SDSEGFP-OmpU 。经 分析和荧光鉴定，发现纯化后重组发光蛋白 的浓度为 1.4mg/mL，纯度达到90%，在 488nm 激发光下可稳定发出亮绿色荧光。 该重组发光蛋白可作为后续黏附功能鉴定的试验材料。 3OmpU蛋白的黏附功能鉴定 以EPC细胞为细胞黏附模型，兔抗OmpU纯化抗体为一抗，FITC标记山羊抗兔IgG 为二抗，DAPI为细胞核荧光染料，采用间接免疫荧光法鉴定OmpU蛋白的黏附功能。 经倒置荧光显微镜观察可见rOmpU与EPC 细胞孵育后，细胞表面出现明显的绿色荧 光点，细胞核呈现蓝色荧光；而只加细胞培养液或荧光标记抗体的对照细胞表面未见 I 万方数据 到荧光，只有细胞核发出蓝色荧光。研究中同时进行了抗rOmpU抗体黏附抑制试验， EGFP-OmpU rOmpU rOmpU 以及重组发光蛋白 与 的黏附竞争试验，结果显示抗 抗体具 有黏附抑制作用；rEGFP-OmpU与EPC 细胞孵育后，细胞表面出现明显的绿色荧光 点，而rEGFP-OmpU与rOmpU共同与细胞孵育时，细胞表面荧光明显减弱。这些结果 均证实rOmpU蛋白具有黏附功能。