cb在椎间盘退中的作用及gdf-5基因导入与bmsc移植的修复研究.pdf

·中文论著摘要· CB在椎间盘退变中的作用及GDF．5基因导入与 BMSC移植的修复研究 目 的 椎问盘突出症是临床骨科的常见病和多发病，也是腰腿痛和颈肩痛的主要原 因，严重影响了人们的生活质量，使大量的社会劳动力丧失，给国家与社会带来 沉重的负担。椎间盘突出是在椎间盘退变的基础上发生的，二者的共同特征是髓 核内细胞外基质成分的显著改变，诸如蛋白多糖含量的减少，导至髓核含水量下 降、纤维环裂隙形成等。椎间盘的累积性损伤也能够触发持续性炎症反应【l】而产 生一系列的炎性细胞因子，促进椎间盘退变的加速。作为一种炎性细胞因子，大 前对于关节软骨细胞的作用研究较多，在椎间盘退变过程中大麻素参与机制的研 究国内外才刚起步，本研究旨在揭示CB在累积性损伤所致椎问盘慢性炎症反应 过程中的表达规律。随着基因强化组织工程学的发展，对椎问盘退变进行分子水 平上的治疗已成为可能，本研究通过采用基因治疗的两种方法：体外基因修饰干 细胞和直接体内基因转染椎间盘细胞，使其在髓核组织内持续表达目的基因，以 减慢椎间盘退变的进程，对这两种基因治疗的效果进行比较和评价，为临床应用 基因疗法治疗椎间盘退变提供科学依据。 方 法 (一)大麻素在累积性损伤所致椎间盘慢性炎症反应中的表达及 意义的初步研究 l、动物模型制备及形态学观察： 根据Jill A．Ulrich制作方法，制备大鼠尾椎反复刺伤模型。在术后第3，7， 10天，取材进行HE染色。 R、CB一2R： 根据大鼠椎问盘相关基因序列，设计引物，利用RealTime-PCR方法检测4 达规律。 3、WesternBlot法检测CB．2R蛋白含量： 提取大鼠椎间盘退变模型髓核后，利用WestemBlot方法检测CB．2R蛋白含 量的变化。 (二)GDF一5体外转染BMSC移植对退变椎间盘的作用 l、兔BMSC分离培养及鉴定 采用密度梯度离心法，分离、纯化兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增， 并进行细胞形态学、表型组织化学染色观察。 取第三代原代培养细胞，脂质体法转染，G418筛选稳定表达株，用倒置显微 镜观察细胞的生长情况和形态学变化，RT-PCR检测转染是否成功。 3、动物手术及2个月椎间盘修复效果检测 转染细胞组、普通BMSC组，对照组分别注入相应混合物，2个月后RT-PCR 观察基因治疗稳定性，并通过髓核蛋白多糖含量，髓核细胞凋亡率观测修复效果。 (三)GDF．5活化基质体内转染对退变椎间盘的作用 1、基因活化基质的制备 I型胶原支架切成直径lmm长5mm的长条经环氧乙烷消毒后备用，按2pl 脂质体含有l肛g质粒的比列稀释，将支架放入其中浸泡30min后进行动物手术。 2、动物手术后2个月椎间盘退变修复效果检测 日本大耳白兔随机分为GAM组，普通支架组，对照组，取术后2个月各组 兔椎问盘的髓核，间苯三酚法测蛋白多糖含量，用流式细胞仪检测髓核细胞的凋 2 亡率，RT-PCR技术检测基因治疗稳定性。 退变修复作用的比较 F1本大耳白兔随机分为正常组，转染细胞组，GAM组，对照组，分别在相应 组中放入目标物(J下常组不予任何处置，转染细胞组置入已转染GDF．5的BMSC， GAM组置入GDF．5活化基质，对照组仅穿刺)，取术后2个月各组兔椎间盘的髓 核，间苯三酚法测蛋白多糖含量，用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率，RT-PCR技 术检测基因治疗的稳定性。 结 果 (一)大麻素在累积性损伤所致椎间盘慢性炎症反应中的表达及 意义 1、HE染色：10天组可见刺伤所致纤维环断裂，髓核内出血。 2、Real．time PCR结果显示：NAAA和FAAH在椎间盘累积性损伤7天时， 表达含量约为对照组的三倍左右，并形成高峰，10天后表达量呈减少趋势。 3、Western Blot结果显示：大麻素受体表达逐渐增