hsv-1编码icrorna分子对细胞转录调控因子klhl24的作用机理研究.pdf

摘要 中文摘要 象的小I斟A分子，作为重要的转录后调控因子miRNA在动物，植物及病毒等 许多物种的转录后基因沉默效应(poSt-饿mscriptionalgenesilencing，PTGS)中发挥 关键作用。它们通过与靶mRNA完全或不完全互补以多种不同机制调控一个或 是多个目的基因的表达，从而在系统发育及疾病发生等多种生物学过程中扮演重 要角色。 病毒IIliI斟A是病毒感染过程中产生的具有I矾A干扰效果的一类分子。首个 病毒删A是2004年在疱疹病毒家族发现的，其功能是调节病毒倒f玳A的转 录。此后，在诸多DNA病毒中均有miRNA报道，它们通常靶向病毒rI删A以 调节病毒蛋白的表达。由于分子较小，mil矾A成为病毒用以抵抗宿主防御的理 想策略。目前有研究报道部分miRNA还可通过干扰宿主细胞基因来重塑细胞内 胞基因的转录。 宿主相互作用中的分子机制及生物学功能开展研究。hsv-miR-P2是我们前期预测 并验证的在HSV-l感染过程中产生的一个病毒miRNA分子，它位于I型单纯疱 疹病毒(HSV-1)立即早期基因』CPD的非编码区。利用靶基因预测软件mi＆mda 的靶基因很可能是宿主细胞基因kelCh like．24(碰m2钓。 我们首先检测产生llsv．miR．P2的病毒HSv．1感染细胞时对靶基因鼻Z上圮刀 的影响。对感染细胞的检测发现，病毒感染下调了miI斟A靶基因砒刀的表 达水平均。为进一步确认hSv．miR．P2的作用靶位点，即碰手圮刀3’UTR受mi对叮A 的调控，我们构建了一个细胞水平检测的报告基因系统：它包含一个miRNA表 达载体以及一个含有靶位点的报告质粒。首先模拟细胞内基因结构将碰月z刀 对报告基因表达影响进行分析。流式细胞仪检测结果表明llSv枷R-P2能够特异 的降低带有碰f圮“3’UTR区报告基因GFP的荧光强度。利用miIⅢA抑制剂 性调控。 宿主细胞基因盟皿刀编码一个未知功能蛋白KEL，我们通过免疫荧光实验 发现该蛋白定位于细胞核中，为了检测l江L蛋白在细胞中的生物学功能，我们 上调KEL水平发现它能够抑制HSv．1病毒立早，早期及晚期基因训[必A的表达。 摘要 利用氯霉素乙酰转移酶CAT系统对病毒启动子区的检测显示，在转染 受KEL蛋白的转录抑制调控。并且可观察到KEL蛋白还能抑制细胞中常见的启 动子近侧序列元件(Promoter proxilll甜sequenCe 的转录效率。同时利用RNA干扰技术敲低细胞中KEL蛋白表达水平，能够增加 一个具有转录调控作用的蛋白，并且对HSv-l病毒的复制增殖具有转录抑制作 用。 为了进一步验证hsv．IIliR-P2在病毒感染水平的影响，我们利用抑制剂 毒基因的转录效率均受到抑制。同时滴度实验也表明llSv-miR．P2敲低的细胞中 复制增殖中发挥调控作用，并促进病毒感染的进程。 通过以上研究，我们发现细胞基因魁皿刀mRNA3’UTR区是病毒编码 IIliIⅢA 调。碰皿刀编码蛋白KEL作为细胞中的转录调控因子，对病毒复制增殖具有 机制下调细胞中的抗病毒因子KEL的表达，从而达到提高病毒感染效率的目的。 我们的工作为病毒通过IIliRNA转录调控水平对细胞的防御体系进行调节的理论 提供了直接证据，并且进一步加深了对病毒感染策略中分子生物学机制的了解。 关键词：micmRNA，hsv．m撼P2，KLHL．24，HSV-1，抑制 2 Abst“lct Abstract a11 encoded RNAsinVolVed Microl冰As(miIⅢAs)arc claSsofsmall endogenously in I斟A haVebeen t0 fImction勰 tha