aflp技术和粒体序列分析在我国巨蛎属牡蛎系统分类中的应用.pdf

——————————二竺燮查塑垡垫堡壁型坌塑垄鍪里里塑墨竺塑墨篓坌耋±塑皇旦 AFLP技术和线粒体序列分析在我国巨蛎属牡蛎 系统分类中的应用 捅姜 长期以来人们一直认为我国有四种具有经济意义的牡蛎：太平洋牡蛎 (Crassostreagigas)、褶牡蛎(Cplicacula)、近江牡蛎(c rivularis)和大连湾牡蛎 (C 存在困难。由于这些争议的存在，有必要采用分子标记对这几种牡蛎进行区分与鉴 定。 扩增片段长度多态性技术(AFLP)是基于选择性扩增完全酶切消化后的基因 组DNA片段。该技术的运用不需要预知基因组的序列特征，具有较高的多态分辨 力，可适用于任何来源和各种复杂度的DNAs。AFLP技术被广泛地运用到动物分 子生物学的研究中。本文利用简化的AFLP技术从基因水平上对太平洋牡蛎、大连 湾牡蛎、褶牡蛎和近江牡蛎进行了初步分类鉴定和遗传多样性分析，探讨了AFLP 技术在牡蛎系统分类学上的应用。在16种引物中，筛选了8种引物对四种牡蛎的 之间。此外，还得到了4条特异性标记(太平洋2条，大连湾和近江牡蛎各1条)， 可作为种的鉴定。数据处理参照RAPD标记的数据分析方法，计算了四种牡蛎群内 遗传多样性参数和种间的遗传距离。结果显示太平洋牡蛎群内遗传多样性不丰富， 间的遗传距离表明：太平洋牡蛎和大连湾牡蛎为O．2818，褶牡蛎和近江牡蛎为0．101l 图。聚类图显示，太平洋和大连湾牡蛎聚在一个组内，而近江牡蛎和褶牡蛎聚在另 一个组内。本研究结果表明，太平洋牡蛎和大连湾牡蛎应为同一种类，而近江牡蛎 和褶牡蛎的很小的遗传分歧可能表明，我们的褶牡蛎样品可能是生活于较高盐度生 境的近江牡蛎，这一点有待于进一步的工作加以证实。 DNA序列分析是检测DNA水平多态性最精确的方法，鉴于我国沿岸几种常见 牡蛎分类比较混乱的现状，利用PCR技术扩增了大连、青岛、宁波和厦门4个不 AFLP技术和线粒体序列分析在我国巨蛎属牡蛎系统分类中的应用 同地理位置的常见牡蛎168核糖体RNA和细胞色素氧化酶亚I单位(coi)基因片段， rRNA基 测定得到的基因片段分别长度分别是488bp和649bp。在31个个体的16S 因序列中共检测到10个多态位点和四种单倍型，在60个个体的COl序列中共检测 到84个多态位点和28种单倍型，转换成氨基酸序列后，在60个个体中检测7个 多态氨基酸位点和7种氨基酸序列。4个地方群内遗传多样性参数显示：宁波和厦 门群内的遗传多样性要高于大连群体，青岛群内多样性最低。由31个个体的16S rRNA基因序列和60个个体的COl基因片段构建的NJ系统树显示青岛、大连的个 体聚为一支，宁波、厦门的个体各自聚为一支，说明各地理位置的牡蛎有不同的遗 传差异。以大连湾牡蛎、太平洋牡蛎、近江牡蛎和美洲牡蛎为外群构建了NJ和MP 系统树，16S和COl的结果一致。系统树显示，大连和青岛牡蛎单倍型和太平洋和 大连湾牡蛎的单倍型总聚在一个组内，而宁波牡蛎和近江牡蛎也总聚在一起，而所 有厦门单倍型和个别大连湾牡蛎(不超过2个)的单倍型聚在一起。氨基酸的系统 树上分成三大支：大连、青岛和厦门与大连湾牡蛎和太平洋牡蛎构成一支；宁波和 近江牡蛎构成另外一支；美洲牡蛎为一支。结果表明在我国沿岸从北到南允布广泛 的，形态颇相似的被认为是“褶牡蛎”的小型牡蛎名称不准确，而且并不是单一种 类，而包括几种不同的牡蛎：很可能至少一种是太平洋牡蛎(青岛和大连)，一种 是生活于较高盐度生境的近江牡蛎(宁波)a 分子标记在牡蛎鉴别与系统分类研究方面，有强大的说服力，如果可以在牡蛎 的分类研究中综合形态学、细胞学和分子系统学等多方面的证据，将会对牡蛎的系 统分类提供一个更完美的解释。 rRNA基因COI基因分子系统学 16S 关键词：AFLP ——————————垒坠垫查塑垡垫堡壁型坌塑垄鍪里至塑堡塾堑墨篓坌鲞±塑窒星 AFLP and mitochondrialDNA technique