apc基因甲基与人宫颈癌细胞增殖及凋亡相关性研究.pdfVIP

内 容 摘 要 目的：检测人宫颈癌细胞系HeLa （HPV18型）、CaSki和SiHa （HPV16型）中结 肠腺瘤性息肉病( adenomatous polyposis coli, APC)基因5端启动子区CpG岛甲基化状 态，探索APC 基因表达沉默是否与其启动子区CpG岛甲基化有关，观察肼苯哒嗪 (Hydralazine)能否作为去甲基化药物诱导APC 基因表达，并进一步探讨肼苯哒嗪对宫 颈癌细胞的生长抑制作用，为宫颈癌的诊断及去甲基化治疗提供新的实验依据。 方法：(1)利用甲基化特异性PCR （Methylation specific PCR, MSP ）检测人宫颈 癌细胞系HeLa 、CaSki和SiHa中APC 基因5端启动子区CpG岛甲基化状态。(2)不同浓 度肼苯哒嗪处理上述三种宫颈癌细胞及正常细胞人脐静脉内皮细胞HECV ，MTT法检 测各组细胞生长情况。(3)MSP法检测肼苯哒嗪处理后HeLa和CaSki细胞中APC 基因5 端启动子区CpG岛甲基化状态；反转录PCR （RT-PCR ）及荧光定量PCR （FQ-PCR ） 法检测肼苯哒嗪对APC mRNA表达的影响；(4)流式细胞术检测肼苯哒嗪对细胞周期 和细胞凋亡的影响，免疫组化SP法检测肼苯哒嗪对APC相关蛋白β-连环蛋白（β -catenin, β-cat ）表达的影响。 结果：(1)MSP检测结果表明HeLa细胞系APC 基因5端启动子区存在CpG岛甲基 化，CaSki细胞系APC 基因为半甲基化，SiHa细胞系APC 基因无甲基化。(2) 5、10、 20 、40 、80、160和320 μmol/L 肼苯哒嗪分别处理三种宫颈癌细胞系及正常细胞 HECV ，MTT法检测到20 μmol/L 以上肼苯哒嗪处理72 h后，三种宫颈癌细胞系的生 长均可被抑制，且抑制率随时间及药物浓度的增加而逐渐升高；当40 μmol/L肼苯哒 嗪处理72 h后，HeLa 、CaSki和SiHa细胞系的生长抑制率分别为(52.12 ±3.78) %、(44.31 ±2.59) % 、(47.73 ±4.73) % ，而同样情况下，正常细胞HECV表现为耐药，抑制率只 有(27.18 ±0.79) % 。 (3) MSP法检测40 μmol/L肼苯哒嗪处理后HeLa和CaSki细胞中 APC 基因甲基化状况，发现APC 基因启动子呈去甲基化状态，RT-PCR检测发现APC mRNA在HeLa和CaSki细胞中均呈阳性表达，FQ-PCR法观察到肼苯哒嗪处理HeLa 、 CaSki和SiHa三种细胞后，APC mRNA表达分别是处理前的10.35倍、11.40倍及0.73倍。 （4 ）流式细胞仪分析发现：40 μmol/L 肼苯哒嗪作用HeLa 、CaSki细胞72 h后，细 胞周期的G0/G1期均显著减少，细胞被阻滞于S期和G2/M期，且凋亡率与对照组比较 均显著增多（P 0.01 ）；SP法检测到40 μmol/L肼苯哒嗪处理HeLa和CaSki细胞72 h后， β-cat蛋白可恢复在细胞膜上的表达。 结论：(1)两种不同HPV型别的 HeLa和CaSki细胞中APC 基因5端启动子区均存 在CpG岛甲基化，APC 基因甲基化在人宫颈癌癌变过程中可能是一种比较重要的分子 调控机制。和CaSki 同为HPV16型的SiHa细胞中APC 基因5端启动子区无CpG岛甲基 II 化，表明人宫颈癌细胞的HPV型别和APC 基因5端启动子区CpG岛是否甲基化无相关 性。(2)肼苯哒嗪能作为去甲基化药物诱导因启动子区CpG 岛甲基化而表达沉默或减少 的APC 基因表达呈阳性或者表达增强。(3)肼苯哒嗪抑制宫颈癌细胞系生长的机制不是 单一的使APC 基因去甲基化。(4)肼苯哒嗪抑制宫颈癌细胞系生长的主要原因是将细 胞阻滞于S期和G2/M期，同时使凋亡增多。(5)肼苯哒嗪处理能阻止Wnt信号转导，相 关癌基因不能转录，这可能也是其抑制宫颈癌细胞生长的原因之一。 关键词：宫颈癌 DNA 甲基化 APC 肼苯哒嗪