免疫组化技术概述-傅椿辉.ppt

* 免疫组化技术概述 傅椿辉 2012.10 纲要 免疫组化基础 抗原修复 一、免疫组化基础 免疫组化原理 抗原、抗体 免疫组化检测的意义 免疫组化原理 应用免疫学原理—抗原抗体特异性结合，结合酶催化底物产生沉淀的化学方法来原位显示组织内抗原的存在与分布状态。 已知抗体检测未知抗原。 一项对蛋白质进行定位、定性及半定量研究的技术。 形态学结合功能。 免疫组化原理 抗原 在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质。 免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性； 反应原性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。 抗体 机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白。 五种亚型： IgA IgE IgM IgG IgD 实验中常用抗体：单克隆抗体、多克隆抗体。 免疫组化检测的意义 ⑴恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； ⑵确定转移性恶性肿瘤的原发部位； ⑶对某类肿瘤进行进一步的病理分型； ⑷软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的； ⑸发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。 ⑹为临床提供治疗方案的选择。 二、抗原修复 原因 常规的石蜡切片标本大多用10%中性福尔马林固定，结果使得：（1）抗原性物质形成醛键、羧甲键而使部分抗原决定簇被封闭了；（2）蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 抗原修复种类 热修复（HIER） 蛋白酶修复（PIER） 双修复（特殊抗原和双染） 不修复 热修复(HIER)的原理（主流为四个学说） “石善溶说”：固定通过改变蛋白结构降低免疫反应性，热修复逆转大部分福尔马林导致的蛋白修饰，冷却后，会重建“近天然”的结构，免疫反应的恢复是通过蛋白表位的复性。 学说一 福尔马林“锁定”蛋白结构并增强它对热变性作用的稳定性。抗原修复抽提出弥散的蛋白，打开固定组织的空隙，抽提钙-蛋白复合物，破坏部分蛋白的分子间交联，并将有机溶剂和石蜡掩盖的蛋白表位再水化。最终去除了蛋白的空间位阻。 学说二 热修复逆转福尔马林造成的交联，进而去除抗体渗透的阻碍，使其接近蛋白的表位。提出交联蛋白经高温处理后展开，并在冷却中得到保持，因抗原的蛋白表位大都是线性的（5~7个氨基酸残基），一级结构是重要的，二级结构和三级结构无关。 学说三 福尔马林导致蛋白修饰通过使蛋白的静电荷中和，造成免疫反应性降低。该中和作用主要是动力学效果。因此热修复的作用是重建蛋白的静电荷。 学说四 蛋白酶修复(PIER)原理 蛋白酶的消化通过破坏福尔马林造成的蛋白交联，实现抗原的修复。 该方法的缺点是：破坏组织的完整性，会破坏抗原，而且酶的浓度，反应时间，反应温度造成很大的差异，标准化难度较大。 抗原修复的操作 热修复（HIER） 蛋白酶修复（PIER） 双重修复 热修复（HIER） 高压修复 煮沸法修复 微波修复 水浴加热…… 高压修复 切片先脱蜡水化 将修复液注入高压锅，将液体煮沸 放入切片（甩开水分） 盖上盖子，等喷气，计时1.5~2分钟（800W~1000W） 冷却，冲洗玻片上的修复液 1.5-2min 10min 煮沸法修复 将修复液注入不锈钢锅中 煮沸后，加入切片（甩干水分） 用保温档，处理20分钟左右 冷却，冲洗玻片上的修复液 热修复的特点 易于实行 易于标准化 蛋白酶修复（PIER） 切片脱蜡水化 切片上滴加酶，放入孵育盒，于37℃处理一定时间 时间到，取出切片，冲洗。 双重修复 脱蜡水化后，对切片进行胰酶消化 然后，对切片进行热修复 抗原修复操作的注意点 时间 温度 冷却 不同的修复方法对实验结果的影响 不修复 柠檬酸高温高压 EDTA水煮 胰酶消化 胃酶消化 一抗：RCC（PN-15） 60分钟 检测系统：MaxVision 15分钟 显色试剂：DAB 5分钟 不同的修复方法对实验结果的影响 不修复 柠檬酸高温高压 EDTA水煮 胰酶消化 胃酶消化 一抗：HBcAg 60分钟 检测系统：MaxVision 15分钟 显色试剂：DAB 5分钟 不同的修复方法对实验结果的影响 MOC-31 MOC-31 MOC-31 MOC-31 结论 正确的修复对抗体的表达十分重要 抗原修复是一个个性化的方法，由抗体的克隆号，病理标本的类型等决定。 合适的修复方法才能获得最佳的修复效果。 2011年全国免疫组织化学专题研讨会 会议现场 授课专家 石善溶 教授 *