荧光标记重组乙型肝炎病毒载体的构建.pdf

目 录 中文摘要……………………………………………………………………一1 英文摘要……………………………………………………………………一5 英文缩写……………………………………………………………………10 研究论文荧光标记重组乙型肝炎病毒载体的构建 前言……………………………………………………………………11 材料与方法……………………………………………………………12 结果……………………………………………………………………24 附图……………………………………………………………………29 附表……………………………………………………………………40 讨论……………………………………………………………………41 结论……………………………………………………………………45 参考文献………………………………………………………………45 综述绿色荧光蛋白标记技术及其应用…………………………………49 致谢…………………………………………………………………………’，／ 个人简历……………………………………………………………………58 万方数据 中文摘要 荧光标记重组乙型肝炎病毒载体的构建 摘 要 Bvirus，HBV)改造为携带外源基 目的：把乙型肝炎病毒(Hepatitis 因的复制型载体，可视化的观察HBV的表达与复制。 方法： 1利用PCR和分子克隆技术构建表达切开绿色荧光蛋白(green fluorescent 1-S2。 pCH-GFPl HepG2细胞，观察GFP表达的强度和特点。 1一S2分 1-Core，pCH-GFPl1-BsdR和pCH-GFPl 3载体质粒pCH-GFPl blot检测HBV复制水平。 pCH．9／3093分别转染HepG2细胞，细胞裂解液直接进行琼脂糖凝胶电泳， 转PVDF膜，应用mc312PO抗体检测重组HBV核心颗粒的形成。 细胞，转染后24h加抑制核心蛋白聚合的药物Bay41．4109，对照组加相 同浓度无活性的Bay41．4842，加药后24h在荧光显微镜下观察细胞内荧 光变化。 6用本实验室构建保存的表达发卡状小干扰RNA(shRNA)的质粒 细胞内荧光变化。 结果： GFPll片段与HBV核心蛋白N端形成融合蛋白的研 第一部分：Split 究 万方数据 中文摘要 置入了一个CMV启动子，替代HBV自身的C基因启动子，用于驱动前 GTG GACCACATG CTGCACGAGTACGTGAACGCC 列为：CGG GCC GGCATCACA，插入至4HBV核心蛋白N端第9位核苷酸之后，再 GACGGCGGCAGCGGCGGCGGatcCGGT连 以一个亲水短肽GGC 酶切鉴定及序列测定证实。 pCH-GFPl 镜下可观察到细胞内很强的绿色荧光表达，以细胞核为主，这一结果与公 认的HBV核心蛋白的正常分布一致。 1-Core及表 3重组HBV核心蛋白颗粒的形成：载体质粒pCH-GFPl 液直接进行琼脂糖凝胶电泳，转PVDF膜，应用mc312PO抗体检测到重 组