恶性疟原虫动力蛋白pfdyn功能研究及感染恶性疟原虫红细胞膜蛋白质组检测数据分析.pdf

中国协和医科大学博士生论文 中文摘要 疟疾是目前地球上对人类危害最严重的蚊媒寄生原虫病。全世界每年有3至5亿人 受到疟原虫感染，二百至三百余万人死于恶性疟疾，其中80％是五岁以下儿童。疟原 虫是疟疾的病原体，寄生于人体的疟原虫共有4种，恶性疟原虫是其中最致命的一种。 由于恶性疟原虫对现有药物的抗药性不断出现和蔓延，蚊媒对杀虫剂抗药性的产生等 因素影响，加上迄今尚无有效的疟疾疫苗出现，致使对疟疾的控制成为世界性的大难 题之一。 对疟疾的防治是多种多样的，可以针对不同的发育阶段和传播环节采取不同的措 施。目前公认最有发展前景的策略包括：1 能够有效抑制疟原虫的某一特殊生命过 程的药物；2 具有预防及治疗作用的疫苗。 恶性疟原虫Pfdyn：譬u本实验筛选出的新虫源基因，前期工作证明对疟原虫的生存 至关重要。为了更深入地了解其功能，本文在原核系统中表达了PFdyn基因的不同结 构域，着重观察了编码蛋白中特异性的c末端区的功能。免疫新西兰大白兔后获得抗 原特异性的抗体，对恶性疟红内期不同发育阶段的表达进行检测，发现Pfdyn仅在红 内期的裂殖体成熟期表达。对不同流行区恶性疟原虫分离株Pfdy郴分内含子及外显 子测序，结果表明外显子编码区高度保守，仅有部分点突变，内含子有部分片断缺失 或移码突变。 根据同源性分析提示，本文又从鼠疟约氏疟原虫的cDNA克隆到全长的Prdy谨因。 内期、蚊胃期及唾液腺子孢子期均有表达。网上数据显示PfdyJEE配予体期也有转录。 提示Pfdyn在疟原虫生活周期的多个阶段都发挥作用，在不同的种属之间具有保守性。 通过对疟原虫基因组数据分析，又找到另一个属于动力素家族的恶性疟原虫基 但在其它恶性疟原虫中没有扩增到相应DNA。对Pfdyn2基因分子生物学特性的研究表 明它在基因组中仅有～个拷贝，但是用Northern microarray及质谱分析数据， 性疟红内期检测到其mRNA。进一步利用最新发表的cDNA 也没有查询到脚蕴红内期的表达，因此判断恶性疟原虫红内期不存在Pfdyn2蛋 白。提示它或者是假基因，或者在其它期表达，承担其它的转运功能。这个结果也提 示恶性疟原虫l。!捌肌基因在红内期单独承担着在高等生物中应由多个动力素家族成员 分别承担的复杂功能。 1 中国协和医科大学博士生论文 和高尔基体外，还可定位于其它部位。用免疫电镜检测，发现金颗粒在吞饮小泡，食 物泡 相当于其它真核生物的溶酶体 、质膜、分泌小泡上均有存在，进一步提示Pfdyn 功能的多样性。 通过利用可阻断高尔基分泌功能的药物BFA的研究发现，Pfdyn与高尔基体的分泌 功能有关。因此本文分别在真核表达载体中克隆了PYdyn全长基因、OTP结合位点突变 型人胎盘碱性磷酸酶分泌的影响。结果显示，3种所砂力基因的表达产物与GFP表达产 物都使细胞分泌水平明显下降，提示Pfdyn分泌功能不适合在COS7细胞中研究。 后12天内全部死亡，实验组2／6只小鼠在感染后18天内死亡，余下的4／6只小鼠在24 天后血中疟原虫完全消失，说明Pfdyn诱导产生的IgO具有部分免疫保护作用。由于通 过对数据库查询发现游离裂殖子中也有Pfdyn的表达，因此Pfdyn的免疫保护作用可能 与抑制疟原虫的入侵有关。 通过上述工作，证实Pfdyn对维持疟原虫生命活动具有重要的意义，提示除作为 新的疫苗候选抗原外，Pfdyn还可能成为新型抗疟药作用的靶点。 本文随后对本实验室利用生物素链亲合素--LC／MS／MS方法批量寻找感染红细胞 外膜表面蛋白的检测数据进行了深入的分析，全面评价了感染红细胞生物膜通透性改 变对生物素衍生物标记一LC／MS／MS检测结果的影响，证明在感染疟原虫后，红细胞膜 的通透性比正常状态时大大增高，从而明显影响生物素链霉亲和素--LC／MS／MS检测 的结果，并对导致这些变化的分子机理进行了全面的分析。在此基础上，发现利用这 一特性，能够将本实验室用蛋白质组技术所获得的59个疟原虫编码候选蛋白定位于 疟原虫细胞膜外至感染红细胞膜内这个特定的区域。由于存在于这一区域内的虫源性 蛋白对抗疟药物的筛选和疟疾疫苗的研制均有重要意义，本文工作为进一步深入进行 红细胞内期疟原虫的相关研究奠定了必要的理论基础。 关键词：恶性疟原虫，动力素蛋白，dsRNA，免疫电镜，LC／MS／MS 生物素链霉亲和素 中国协和医科大学博士生论文 data ofnovelPtasmodiura and a dynamingene analyzing Characterizing fatciparum withP缸smo觑m of for infected fatc伽[rum erythrocyte proteomictechni