人lgr5基因染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制.pdfVIP

人Lgr5 基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制 中文摘要 中文摘要 肿瘤是威胁人类生命健康的最重大疾病之一，近年来， 随着对干细胞及肿瘤 生物学研究的深入，提出肿瘤干细胞（tumor stem cell ，TSC ）理论。TSC 是一种 特殊类型的干细胞，具有自我更新能力。TSC 在肿瘤的发生发展中起关键性作用， 它与肿瘤的转移、抗药性的产生以及治疗后的复发有密切关系。TSC 数量少且难 以检测，因此对其标记物的研究必将对肿瘤发生发展的了解及肿瘤的临床诊断、 治疗都带来深远的影响。 近年来，G 蛋白偶联受体Lgr5 （leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 5 ）作为新兴的标记分子成为干细胞的研究热点。Lgr5 ，又名GPR49，HG38 ， FEX ，是G-蛋白偶联受体超家族成员，是由具有18 个富含亮氨酸的重复单位和7 个跨膜区域组成的大分子蛋白，在人体内分布广泛，大脑、脊髓 、乳腺、毛囊、 眼睛、生殖器官及胃肠道等都有表达。2007 年首次提出Lgr5 是结肠肿瘤干细胞表 面标志物，是最新发现的 Wnt 信号传导的目标基因，与肿瘤的形成和发展有很大 相关性，可以作为新的治疗靶点。鉴此，研制特异性抗人Lgr5 单克隆抗体不仅在 理论研究中具有重要意义，而且在临床应用中也具有重要潜在价值。 本课题研究旨在通过克隆人Lgr5 全长基因，建立CHO/Lgr5 稳定基因转染细 胞株，以CHO/Lgr5 稳定转染细胞株为免疫原，常规免疫BALB/c 小鼠，研制获得 鼠抗人Lgr5 单克隆抗体，同时构建SW480/Lgr5 瞬时基因转染细胞株，以研究Lgr5 基因对结肠癌细胞株体外生物学特性的影响，为进一步研究人Lgr5 分子的生物学 特性及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。 本论文分为两个部分： 一、人Lgr5 基因转染细胞株的构建及Lgr5 基因对结肠癌细胞株生物学特性 影响的研究 【目的】构建pIRES2-EGFP-Lgr5重组表达载体，获得能稳定表达人Lgr5分子 的CHO/Lgr5基因转染细胞株，为研制鼠抗人Lgr5单克隆抗体提供免疫原。构建 SW480/Lgr5瞬时基因转染细胞株，探讨转染Lgr5基因对结肠癌细胞生物学特性的 I 中文摘要 人Lgr5 基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制 影响。 【方法】运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR ）技术从结直肠癌组织中获得 Lgr5全长基因，经双酶切（Xho I和BamHI ）连接入真核表达载体pIRES2-EGFP 中， 利用脂质体法转染CHO细胞，经G418长期加压筛选获得稳定表达Lgr5分子的CHO 基因转染细胞。经RT-PCR 、Western blot 、免疫细胞化学法检测Lgr5分子的表达。 利用脂质体法将pIRES2-EGFP-Lgr5重组表达载体转染SW480细胞，经Western blot 、 免疫细胞化学法检测Lgr5分子的表达。CCK-8法和悬滴实验分析Lgr5对结肠癌细胞 增殖率和成球能力的影响，划痕实验分析Lgr5对结肠癌细胞迁移能力的影响。 【结果】（1）成功克隆人Lgr5全长基因，构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Lgr5 ， 并构建稳定表达人Lgr5 的基因转染细胞株CHO/Lgr5 ；（2 ）获得SW480/Lgr5瞬时基 因转染细胞株，转染Lgr5基因的结肠癌细胞体外增殖速度加快，形成的细胞球大 而紧密，迁移能力下降，由此提示Lgr5基因转染对结肠癌细胞的生物学行为有一 定的影响。 二、鼠抗人Lgr5 单克隆抗体的研制及Lgr5 在结直肠癌组织中的表达及其临 床意义 【目的】研制鼠抗人Lgr5 单克隆抗体，分析Lgr5 在结直肠癌组织中的表达及 其临床意义，为进一步探讨人Lgr5 的生物学特性奠定物质基础。 【方法】以稳定表达人Lgr5 的基因转染细胞株CHO/ Lgr5 为免疫原，常规免 疫BALB/c 小鼠，采用B 淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠