人参皂苷rbt;,1gt;水解酶的分离纯化及其性质的研究.pdf

人参皂苷Rb。水解酶的分离纯化及其性质的研究 硕士研究生： 刘欣 指导教师： 崔昱 教授 指导小组： 杨凌 研究员 专业名称： 病原生物学 摘 要 人参皂苷Compound l —D—91ucopyranosy 由天然二醇型人参皂苷(protopanaxadio卜type 皂苷Rb，、Rb：、Rd等经肠道菌分解代谢转化生成。目前研究表明，它具有抗突变、 抑制癌细胞转移、抗肿瘤细胞毒、诱导肿瘤细胞调亡、逆转肿瘤耐药和抗肿瘤诱 导的血管新生等多种药效活性，在韩国已进入III期临床研究。因此，C—K的大量 制取和生产方法成为产业化的关键而备受关注。 目前通用制取低极性人参皂苷的方法有酸水解、碱水解、Smith降解和热解等 化学方法，因化学水解法首先去除人参皂苷C。位的糖基，因而C—K只有通过生物 转化的方法制备获取。在生物转化方法中，酶法降解由于其具有条件温和、步骤 简单、选择性高、副产物少的优点，已成为制各人参皂苷C—K的首选。中国科学 院大连化学物理研究所1806组通过实验研究，已从多种不同来源的水解酶中筛选 出一种软体动物来源、可高效降解人参皂苷Rb。的混合酶，命名为sE酶。本实验 选定SE酶作为分离纯化的对象，通过筛选、分离和纯化Rb。水解酶，为研究糖苷 酶水解功能和性质奠定基础。 本论文从糖昔酶的检测手段入手，以原酶为对象对比了定性和定量的糖苷酶 活性检测手段，在定量方法中比较了以人工底物剧PG等和天然底物人参皂苷Rb。 为酶解对象的作用条件，结果显示：l、定性方法主要采用聚丙酰胺凝胶电泳，SE 原酶上样量在7～lO“g左右为适：2、在进行糖苷酶分离纯化过程中，人工底物pNPG 显度40℃，DH为4．5。 为了确定纯化的条件，本实验比较了数种分离纯化的方法：1、硫酸铵盐析与 乙醇沉淀法处理量大，但分离纯化效果不佳；2、DEAE—sepharose离子交换层析、 HA层析和凝胶过滤层析对SE酶均有较好的分离效果。3、DEAE离子交换层析和sE 酶糖苷酶荧光活性染色结果显示，SE酶中至少含有7种以上糖苷酶的同功酶；HA 层析结果显示目标酶是中性或酸性蛋白质。 在上述工作的基础上，我们设计出一套合理而可行的实验方案，通过 SephadexG一100凝胶过滤层析三种方法的联用将SE酶中能够水解人参皂苷Rb。的 永解酶分离和纯化至SDS—PAGE上呈单一蛋白质条带，并通过活性染色证实。应用 SDS—PAGE和凝胶过滤层析对分子量的测定，提示该酶是由4个分子量为110~115KD 的相同亚基组成。 最终，我们对纯化的目标酶进行基本酶学性质的分析：1)目标酶的最适pH 值为5．6，最适温度是80℃。pH稳定范围报广，在口H4．0的溶液中和温度60℃ 以下保持长时间稳定状态，是一个耐碱和中等耐热的糖苷酶。2)目标酶对Na+、 K+、Li+、ca2+、 mM和O．189 双倒数做图法，pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为O．182 rnM和lO．192 umol／rnin，mg：以Rbl为底物的动力学参数}：m和Vmax分别为O．790 umol，m甜mg。4、在本实验条件下，Rbl的酶经时作用中只监测到产物Rd的存在， 该结果的意义还需要进一步验证。 本实验从SE中分离纯化出一种新型、高效水解人参皂苷Rb，的B一葡萄糖苷 酶，为天然人参皂苷和其它天然糖苷类化合物的生物转化产物的发现、开发和应 用提供有效的工具并奠定了基础工作。 B—葡萄糖昔酶糖昔类化合物 关键词：人参皂苷Rb。人参皂苷cK Puri6cation andCharacterizationof aGinsenoside—RblB-G1ucosidase Hydrolyzing