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人微小病毒B19-VP2基因真核表达质粒的构建 硕士学位申请人 彭新 推荐导师 赵国强武峰 郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室(郑州450052) 摘要 Parvovirus 研究目的：人微小病毒B19(Human B19)系微小病毒属中唯一能致人 类疾病的一种病原体，可引起传染性红斑、再障危象等多种人类疾病。目前尚未 建立针对该病毒的特异性疫苗，对人微小病毒B19感染的预防和治疗是急待解决 的问题。近年来国外开始把B19的衣壳蛋白作为疫苗抗原进行研究。本课题的目 的是利用真核表达质粒pcDNA3．1为载体，将选择出的B19一VP2抗原表位丰富区 基因片段重组其中，构建出pcDNA3．1一VP2重组表达载体，并将重组质粒免疫动 物，观察其免疫效应，以探讨人微小病毒B19一VP2基因作为基因疫苗的可行性， 为最终建立针对该病毒的特异性实用疫苗奠定基础。 方法：从人微小病毒B19的基因序列和结构分析中可获得B19一VP2的氨基酸序列， B19一VP2靶区域引物，为了克隆方便和插入方向正确，特意在两条引物上分别加 TT／SP6序列设计出引物对连接的正确性进行鉴定，利用AMP抗性对阳性克隆进 行筛选，并进行DNA测序，以保证克隆的目的片段的正确性；将重组质粒 I酶切，电泳纯化后进行亚克隆， pGEM—T—VP2和pcDNA3．1同时用HindⅢ和BamH 转化细菌，再次筛选和鉴定出阳性克隆，并进行DNA测序。大量培养、提取、纯 化pcDNA3．卜VP2，肌注家兔，动态采血，ELISA方法测特异性抗体。 结粜： 1．寝位分辑：逶遘对VP2鹣294-541位氨藜酸亭弼分轿，镪步确定了9个寝位。 FKLGP醚矗tGR疆K(萤LYDPTATDAKQHHRHGYEK 2，靶基因扩增：以食有B19病毒全基因的质粒为模板，利用PCR扩增得到VP2 基因中的靶基因(4168—4968)，熬800个碱基对。 3．巍隆帮鼗克隆耋缀子结祭鉴定：褪基嚣与茹醺～善矮粒逡接君，滚T7／SP6俸为 引物对转化后的质粒进行筛选扩增，得到960bp的阳性克隧，证实B19一VP2靶基 化爝的质粒进行扩增，得到966bp的阳性克隆。证实B19一VP2靶慕因成功插入 pcDNA3．1，即得到pcDNA3．卜VP2徽组质粒。 4．竞整瓣亚亮豢重缀予测穿终栗：慰签定褥到豹巍隆纛驻竟隆鬟缝子 基因片段的碱基组成与公开发表的VP2序列完全一致，即成功构建pcDNA3．I-VP2 冀孩表达载钵。 5．ELISA结果：实验动物的体内产生了高效价的抗B19病毒的IgG抗体。 绐论：本课题利用分予生物学软件分析出B19-VP2抗原袭位丰富区，确定了9 个莰原表经，主要集中予294—541霞氨基羧廖到孛。剥震分子生携学的方法，成 物体内产嫩了较强的免疫威答。通过此项研究，为人微小瘸毒B19基因疫菌的研 制奠定了凝实豹鏊破，势必遴一步磺究基予VP2鹣表位生物学帮袭位疫蓥提供了 详实的数据。 关键词：入微小病毒B19：VP2；基因疫苗；真核表达 2 ofHuman B19一VP2 ConstructionParvovirus in ofPlasmid geneEucaryotic Expression for Master Applicant DegreePengxin TutorsZhao Wufeng Guoqiang