溶藻弧菌诱导凡滨对虾差减文库的构建及其表达序列标签分析.pdf

溶藻弧菌诱导凡纳滨对虾差减文库的构建 及其表达序列标签分析 摘要 抑制性差减杂交是一个产生差异表达或组织特异性cDNA探针及文库的高效率的 新方法，适用于疾病、发育、组织特异性和其它差异表达基因的克隆研究。本研究按 照Clontech公司PCR．SelectmcDNA差减杂交试剂盒的说明，建立了基于PCR方 法的凡纳滨对虾的差减杂交文库，用来筛选免疫刺激后表达的免疫相关基因。首先分 别提取正常凡纳滨对虾和免疫刺激后对虾血细胞mRNA，合成双链cDNA，分别称 为drivercDNA和testercDNA。两种双链cDNA同时用RsaI酶切，然后把tester 2R) cDNA稀释后在同样的反应条件下分别与接头1(Adaptor1)和接头2R(Adaptor 连接，drivercDNA不加接头。接下来是两次杂交反应，在第二次杂交反应中，只有 均化和消减后的单链testercDNA能够重新杂交，形成新的5·端有不同接头序列的 杂交体。这两种接头序列使接下来在用巢式PCR引物l和巢式PCR引物2R两 种