土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(定稿)精要.pptVIP

课题2 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数 尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。 只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3 细菌脲酶 一、课题背景 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等； 方法： ⑴抑制大多数微生物的生长 ⑵促进目的菌株的生长 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 二、研究思路 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 （一）筛选菌株 （一）筛选菌株KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。 该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮源而生存。 （二）统计菌落数目： 1、活体计数法（稀释涂布平板） （1）操作方法： 稀释涂布平板→统计菌落数 （2）原理： 1个菌落→1个活菌 （3）统计原则 ①选 30～300 个菌落的平板统计 ②每个稀释度取3个平板取其平均值 为什么？ 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值 注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 计算公式： 每克样品中的菌株数 =（C÷V）×M 某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得 平板上菌落数的平均数为234，那么每克样 品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液 的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。 设置对照—同等条件下，培养空白培养基 ㈡.统计菌落数目： 2.直接计数法：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。 每毫升原液所含细菌数 ＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 （三）设置对照 判断培养基中是否有杂菌污染： 将未接种的培养基同时进行培养。 判断选择培养基是否具有筛选作用： 完全培养基（营养成分齐全）接种后培养 观察菌落数目。 主要目的是排除实验组中非测试因素对实验 结果的影响，提高实验结果的可信度。 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。 原因： ⑴土样不同 ⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 三、实验过程 （一）土壤取样