实验十双层平板法观察蛭弧菌斑实验精要.pptVIP

双层平板法观察噬菌蛭弧菌斑实验 实验 十 一、蛭弧菌简介 蛭弧菌(Bdellovibrio)是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌。它虽然比通常的细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用，但它不是病毒，是一类能吃掉细菌的细菌。 1962年首次发现于菜豆叶烧病假单胞菌体中，随后从土壤、污水中都分离到了这种细菌。 特征 蛭弧菌属于蛭弧菌科。具有细菌的一切形态特征： 单细胞，弧形或逗点状，有时呈螺旋状 0.3-0.6×0.8-1.2微米，或仅为杆菌长度的1/3-1/4 端生鞭毛，比其他细菌的鞭毛粗3-4倍，运动活跃 革兰氏染色阴性。 细胞中蛋白质含量较高，有的占干重的60-70%。DNA含量5%，GC百分数为42-51%。 生活方式 有寄生型，也有兼性寄生，极少数营腐生。非寄生型营腐生生活，可在蛋白胨和酵母提取物培养基上生长繁殖，绝大多数都丧失了寄生性。 从自然界分离得到的蛭弧菌都是依赖寄生型，迄今为止，还没有直接从自然界分离得到非寄生型。不依赖宿主的蛭弧菌，只能生活在实验室条件下。 生长要求 寄生型蛭弧菌生长，要求pH6.0-8.5；温度23-37℃，低于12℃，高于42℃时均不生长；能稳定分解蛋白质，一般不利用碳水化合物，而以肽、氨基酸作碳源和能源；能液化明胶；严格好氧。 侵入对象 蛭弧菌与宿主细胞之间，常表现出一定的特异性。不过，有的特异性较差，能侵入多种细菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各类不同的植物病原菌。 侵入机理 周质空间 分布和分离 广泛存在于自然界，土壤、河水、附近海洋水域及下水道污水。 将蛭弧菌与敏感菌混合倒平板，在适宜条件下培养2-3天，平板上便会出现类似噬菌体的噬菌斑，并逐渐扩大，宿主细胞完全被溶解而形成透明区。从这些透明区中就可分离到蛭弧菌。利用这一特征，还可计算出蛭弧菌噬菌体的数目。同时可追踪增殖过程、寄生潜伏时间、新产生蛭弧菌的数量以及它们的活性等。 应用价值 用于净化水体和清除工、农、医等方面的有害细菌。 大量存在于污水中，对大肠杆菌和沙门氏菌属的细菌均有广泛的寄生性，因此，有人以蛭弧菌作为水域污染程度的一项最终指标 理论研究：宿主细菌-蛭弧菌-蛭弧菌噬菌体这个三位一体的寄生系统。 二、实验目的 1. 了解噬菌蛭弧菌的生物特性 2. 掌握双层平板法分离蛭弧菌技术 三、实 验 材 料 仪器 显微镜，生化培养箱，电子天平，高压灭菌锅，电热干燥箱，超净工作台，冰箱，高速离心机，普通离心机。 菌种 　　大肠杆菌（Escherichia coli）、噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovoru）。 实验试剂 （1） 牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉粉5g（0.5%）；蛋白胨10g（1%）；琼脂20g（2%）；蒸馏水1000ml；pH 7.0～7.2 （2） 双层平板培养基 　　　 下层琼脂培养基：琼脂17.5g（1.75%）；蒸馏水1000ml 　　　 上层LB培养基：蛋白胨5g（0.5%）；酵母提取物1.5g（0.15%）；NaCl 2.5g（0.25%）；琼脂4g（0.4%）；蒸馏水1000ml。 大肠杆菌的制备 将大肠杆菌接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，放在37℃培养箱里培养24 h后，备用。 　　　　　 四、实 验 程 序 　　1. 利用双层平板法分离噬菌蛭弧菌 　2. 观察噬菌蛭弧菌斑出现及其形态的观察 即：通过双层平板法使噬菌蛭弧菌对大肠杆菌的裂解而形成噬菌斑。 　　　 双层平板法主要优点： 五、实验方法及操作 1、 蛭弧菌悬液的制备：挑取蛭弧菌单斑浸泡于1.5 mL 无菌水中，捣碎混匀，10000 g离心1 min，得到蛭弧菌悬液，备用。 2、大肠杆菌悬液的制备：取0.5 mL无菌水在大肠杆菌的斜面上，用接种环钩分散乳化菌苔，制备菌悬液，备用。 3、倒入融化的琼脂培养基20ml于无菌培养皿中，冷却凝固，备用。制作下层琼脂培养基。 4、吸取3.5 mL上层LB培养基（50℃）中加入0.2mL蛭弧菌液和0.3 mL大肠杆菌菌悬液，混匀后立即倾注于下层培养基上，待凝固后置于35℃培养箱内培养24h-120 h。 试验操作注意事项 1、上层LB培养基温度必须控制在50℃左右，温度过高导致大肠杆菌和蛭弧菌失活。 2、加入0.2mL蛭弧菌液和0.3 mL大肠杆菌菌悬液时动作要快，倒入下层培养基上迅速摇匀，避免LB培养基凝固。 3、一定要等培养基凝固后，在倒置培养。 六、实验结果 1、观察噬菌斑出现及大小 2、记录噬菌斑个数 七、思考题 1.比较双层平板法与单层平板法的特点。 2.噬菌蛭弧菌生长与其他细