yangying.doc

1. 什么是western blot?答：WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。 2. western blot 有什么优点？答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。 3. western blot 的具体步骤是什么？答：一. 制样（以提动物组织总蛋白为例），1） 组织洗涤后加入3 倍体积PBS，0℃研磨。2） 加入5×STOP buffer3） 180W, 6mins，0℃超声波破碎4） 5000rpm，5mins 离心，取上清。5） 加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）6） 煮沸，10min7） 分装，于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。二． 电泳（SDS）建议欲检测抗原10－30kd, 用15％胶；30－100kd, 用10％胶；100－200kd，用7.5％胶。1）配胶（one piece）A.分离胶。单位：ml。Total: 8ml7.5％ 10％ 15%2×Sep. buffer 4 4 430％ Gel.sol 2.0 2.7 4ddH2O 1.9 1.2 0TEMED 8ul 8ul 8ul10%APS 80ul 80ul 80ulB. 浓缩胶。单位：ml。Total: 3.5ml3％2×Stacking. buffer 1.730％ Gel.sol 0.35ddH2O 1.4TEMED 5ul10%APS 50ul2)点样。上样蛋白量不应超过30ug/mm2. (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm, 则载荷面为：1mm×5mm=5mm2)，3）电泳。开始用80V电压，但是当溴酚蓝至分离胶时，用100-120V电压。4）转移（一块胶）。A.半干法。a. 取六张滤纸（Bio-Rad，1mm），三张做上层滤纸，三张做下层。其中，上层滤纸一定要比较干净，无污染。用前都用Transfer buffer 浸泡至少五分钟。b. 准备硝酸纤维素薄膜，用时先用甲醇浸泡1-3min.倒掉后，再用Transferbuffer 浸泡。c. 做三明治。阳极上铺三张下层滤纸，再浸泡过的膜，再铺胶，然后铺三实验方法互助区——蛋白区张上层滤纸，最后铺上三张上层滤纸，盖上阴极。注意每层之间不能有气泡。膜上用铅笔画出胶的边缘。标上下。d. 转移，0.8mA/cm2-3mA/cm2. 经验是：100kd-200kd，用2mA/cm2，2hrs;30-100kd用1.0-2.0mA/cm2，40mins-1.5h；10kd-30kd％用0.5-0.8mA/cm2，15mins-40mins.B.湿法。a. 取四张滤纸，两张做上层滤纸，两张做下层。其中，上层滤纸一定要比较干净，无污染。b. 准备硝酸纤维素薄膜，用时先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉后, 再用Transferbuffer 浸泡。c. 做三明治。e. 转移。抗原≥100kd, 先28V转移1h, 然后84V转移14-16h, ≤100kd， 则63V转移4-16h.三封闭：5％牛奶4℃封闭过夜，或RT 1hr.四第一步反应：5％牛奶或2％BSA稀释抗体（称一抗），稀释比例按抗体说明,室温孵育1hr，五洗涤：TBST 洗5 mins 3-5 次。六第二步反应：将膜跟5％牛奶或2％BSA稀释的2 抗一起孵育，室温1hr。七洗涤：TBST 洗5 mins 3-5 次。八显色：4. western blot 所需buffer 的配方是什么？答：主要的buffer有：1） 2×Separation buffer (PH: 8.8)0.75M TRIS.HCl 90.825g0.2% SDS 10ml 20% SDSTotal: 1000ml2) 30% gel Solution0.8% kis-aciylamide 0.8g29.2% aciylamide 29.2gTotal: 100ml3）10％ APS: 0.1g 溶于1.0ml ddH2O.4) 2×Stacking buffer(PH: 6.8)0.2M Tris 15.14g0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDSTotal: 500ml5) 10×Running buffer(PH: 8.3)250mM Tris 60.55g1.9M Glycine 285.27g1% SDS 20g or 100ml 20% SDSTotal: 2 liters6) Semi-dry transfer buffer(PH:8.3):48mM Tris 5