nk4慢病毒载的构建及对人肝癌细胞的生物学特性的影响.pdf

·中文论著摘要· NK4慢病毒载体的构建及对人肝癌细胞 的生物学特性的影响 目 的 factor,HGF)在肿瘤发生进展过程中 根据肝细胞生长因子(hepatocytegrowth 的促进作用和NK4对HGF的拮抗作用，构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧 光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体，转染人高侵袭转移肝细胞肝癌 (Hepatocellular NK4高表达后，HCCLM3细胞增殖、凋亡的改变，及对细胞侵袭能力的影响。 方法 chain cDNA中克隆NK4 reaction，PCR)从HGF 采用聚合酶链反应(Polymerase 基因，并经测序鉴定。将NK4基因与带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6．3．内部 达载体并鉴定。利用293T细胞进行慢病毒的包装，将病毒原液浓缩，测定病毒滴 度。以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞，筛选出最适MOI转 blot法测定细胞中NK4 染HCCLM3细胞，荧光显微镜下观察转染效率。Western V．PE／7．AAD双染后用流式细胞术分析转染NK4对HCCLM3细胞凋亡的影响。 通过Transwell法检测转染后HCCLM3细胞侵袭能力的变化。 结果 1、PCR获得目的基因片段，凝胶电泳观察到约1344bp的特异条带，经酶切 定，结果显示在9300bp附近有一特异性条带，与预期相符合，提示含NK4／EGFP 对一致。 48h，荧光倒置显微镜下可观察细胞有绿色荧光表达，转染效率高达90％以上。 胞NK4高表达。Westernblot检测发现，稳定转染NK4基因的HCCLM3细胞能 够自分泌分子量约50KD的NK4蛋白。 组在各个时间点的细胞增殖情况显示，各时间点(除24h外)，NK4转染组细胞 生长明显减少，与空载体组、对照组相比有显著性差异(尸o．05)；空载组和对 照组比较，差异无显著性(P0．05)。 4、流式细胞仪分检测NK4组、空载体组和对照组细胞凋亡，NK4转染组细 (6．51士0．23％)相比，差异有统计学意义(尸O．05)；空载体组细胞凋亡与对照 组相比无明显差异。 5、当细胞培养基中有HGF存在时，对照组和空白载体组的侵袭力显著高于细 胞培养基中无HGF(PO．05)存在时，说明HGF可以显著提高肝癌细胞的侵袭能 力。当有HGF存在时，NK4组通过的数量明显少于对照组和空载体转染组 (P0．05)；但当培养基中无HGF存在是，NK4转染组、空载体组、对照组细胞通 用。 结 论 粒。经测序鉴定及酶切鉴定结果与预期相符，为NK4基因的体外实验研究提供基 础。 2、用最适MOI转染HCCLM3细胞后，筛选阳性克隆后进行指标检测，稳定 转染NK4基因的HCCLM3细胞可以自分泌NK4蛋白。 2 3、体外实验证明NK4可以有效抑制HCCLM3的增殖，诱导细胞凋亡，并且 降低了细胞的侵袭能力，为HCC的治疗及预防转移提供了新的途径。 关键词 NK4：基因治疗；慢病毒载体；人高侵袭转移肝癌细胞 3 ·英文论著摘要· The vector constructionofNK4recombinantlentiviral of andtheeffectont